甘蔗rapd標記特異性片段的設計與scar標記轉化

甘蔗是世界上最重要的糖資源之一，其遺傳背景非常復雜。甘蔗屬（Saccharum）內分為熱帶種（S.officinarum）、印度種（S.barberi）、中國種（S.sinense）、割手密種（S.spontaneum）、大莖野生種（S.robusfum）等多個原始野生種（彭紹光，1985）。現代甘蔗栽培品種均是經種間雜交育成的含有為2～5個種的血緣復雜多倍體。因此，尋找甘蔗親本種特異DNA序列，進而轉化成為特異PCR標記，將可作為甘蔗種質鑒定及遠緣雜交種鑒定的有效工具。近年來，植物特異DNA序列的篩選與應用己取得進展，并已應用在鑒定外源染色體的來源、種質鑒定、外源染色體的識別以及有關基因組研究等方面（王英等，2007；莊南生和鄭成木，2002）。而有關甘蔗種質的特異DNA序列的研究與應用的報道很少（Selvetal.,2003；莊南生等，2004），至今尚未見利用隨機擴增片段長度多態性(randomfragmentlengthpolymorphism,RAPD)的片段構建甘蔗祖親種特異PCR的報道。RAPD分子標記是Williamsetal.(1990)和Welshetal.(1990)發明的一種技術。以PCR技術原理為基礎的RAPD標記以其操作簡單、經濟快捷等優點在種質鑒定、種質資源評估以及遺傳多樣性和親緣關系分析上得到了較為廣泛的應用，但重復性和穩定性較差是RAPD標記較難克服的缺陷。將RAPD標記轉化成序列特征性片段擴增區域(sequencecharacterizedamplifiedregion,SCAR)標記，進行種、屬的快速鑒定(Lahgueetal.,1998)。SCAR標記其特異性和穩定性均比RAPD的大幅度提高（黃朝峰等，2000），目前已在很多的作物如水稻（向太和等，2003）、麥類（黃朝峰等，2000）、大豆、油菜以及一些觀賞植物與果蔬如草莓（Albanietal.，2004；王志剛等，2007）、桃（吳俊等，2004）等研究中，用此技術進行了系統分類、種質鑒定及相關性狀連鎖基因克隆等方面的研究（吳俊等，2004；郭立海等，2002;Hermosaetal.，2001；賈繼增，1996）。本研究利用RAPD特異片段轉化成甘蔗祖親種特異SCAR標記，旨在為甘蔗種質鑒定及遠緣雜交的雜種鑒定提供基礎資料。1材料和方法1.1原種和屬種種供試的甘蔗種質共96份。其中39份祖親種包括熱帶種(Saccharumofficinarum)、印度種(S.barberi)、割手密種(S.spontaneum)、大莖野生種(S.robustum)、中國種(S.sinense)、斑茅（Erianthusarundinaceus）和河八王原種；其它57份為雜種F，或栽培品種(表1)。那高利、Nagans、Pansahi、57NG208及云南割手密系列引自云南甘蔗育種研究所，其余材料均引自中國輕工總會甘蔗糖業研究所海南甘蔗育種場。各種質的血緣是根據其育種系譜查證而確定的（彭紹光，1985）。1.2方法1.2.1ctag法用于提取遺傳因子的總dna王英等人，20081.2.2rapp試驗程序1.2.2.rapd片段的篩選參照曾華宗等（2003），對多態性豐富的25條RAPD引物以12份親本種進行特異RAPD引物篩選，獲得了最有可能找出甘蔗親本種種特異帶的3條引物S418、S1367及S427，進而選用36份親本種質用這3條引物分別進行RAPD標記，用于篩選甘蔗祖親種特異RAPD片段。所用的引物序列為：1.2.2.pcr反應程序PCR擴增反應體系的總體積為20μL,包括10×Buffer2.0μL,模板DNA(10ng/μL)2.0μL,MgCl2(25mmol/L)2.0μL,dNTPs(2mmol/L)2.0μL,引物(5μmol/L)2.0μL,TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.3μL,ddH2O到20μL;擴增反應程序為94℃預變性5min后,94℃變性7min,38℃退火1min,72℃延伸90s,45個循環;72℃延伸5min。采用1.5%瓊脂糖凝膠(加入EB使其終濃度為0.5μg/mL)電泳檢測PCR擴增產物。1.3rapd標記系統的純化用手術刀片刮下凝膠中的特異條帶并置于1.5mL離心管內，根據試劑盒說明采用鼎國公司生產的DNA快速純化/回收試劑盒進行RAPD標記特異條帶的回收及純化。1.4陽性克隆的篩選、克隆測序用華美生產的大腸桿菌（Escherichiacoli)DH5α制備感受態細胞，采用上海生工生產的pUCm-T克隆試劑盒進行片段的連接后并進行轉化，在表層含有X-gal(BBI）和IPTG(BBI）添加有Amp(AMRESCO）的LB(Sangon）培養基上進行陽性克隆的篩選，經PCR檢測（方法同1.2.2.2，不同處在預變性10min）后確定為陽性克隆的，再挑單克隆進行固體穿刺培養后，由上海生工完成測序。2結果和分析2.1甘蔗rapd擴增產物的擴增和測序對25條RAPD引物的特異RAPD篩選，其中12份甘蔗親本種基因組包括熱帶種黑車里本與拔地拉，割手密種崖城割手密與印度割手密，印度種春尼與那高利，大莖野生種NG77/001與NG77/004，中國種育巴和廣西竹蔗，斑茅種崖城斑茅2號和紅花斑茅。經檢測、篩選，獲得了最有可能找出甘蔗親本種種特異帶的3條引物S418、S1367及S427。再用這3條引物分別對36份親本種基因組DNA進行RAPD擴增，用于篩選甘蔗親本種特異RAPD片段。在甘蔗屬中，熱帶種、割手密種和印度種是雜交育種中最重要的親本種，而黑車里本（熱帶種）、印度割手密（割手密）、春尼（印度種），是親本種中最常用的種質，以至多數現代栽培品種都含有它們的血緣。本研究單獨將黑車里本、拔地拉、崖城割手密、印度割手密及云南割手密種質同NG77/001（大莖野生種）和育巴（中國種）一起進行了RAPD分析，從S418、S427及S1367引物的RAPD擴增產物中回收了甘蔗親本種的特異條帶42條。各份種質的回收帶所占比例各不相同，其中割手密種特異的21條，熱帶種特異9條，野生種特異2條，親本種多態性條帶10條。在所回收的特異條帶中，以割手密占的比例最多（占50%），這說明，割手密種的條帶多態性高于甘蔗屬中的其它種，表明割手密種與其它種間存在較大的遺傳差異。其中引物S418及S1367引物對36份甘蔗親本種及6份親本種的混合基因組DNA進行RAPD擴增的結果分別見圖1和圖2。從圖1可見，用S418引物進行RAPD擴增時有一條分子量大小約為970～985bp的片段（如a）為甘蔗屬特異帶；在分子量大小約為433bp（如b）處有一代表割手密種的特異帶，該帶在其它親本種中均未擴增出，命名為Rsp2；在分子量大小約為560～580bp（如c）處，印度割手密能擴增出一條清晰而區別于其它種質的印度割手密種特有帶，命名為Rsp5；在分子量大小約為700bp（如d）處，大部分云南割手密種質有的一條清晰的區別于其它種質的特有帶，命名為Rsp6；在分子量大小約為1420bp（如e）處，印度割手密有一條清晰的區別于其它種質的特有帶；而在所有割手密種上都基本共存一條分子量大小約為1612bp（如f）的種特異帶。從圖2可見，用S1367引物進行RAPD擴增時，能在熱帶種和大莖野生種中擴增出一條大小約為970～985bp（如a）的片段，而在割手密種、中國種、印度種等種質中無此擴增片段，命名為RSo13；同時能在割手密種、中國種、印度種擴增出一條大小約為590～596bp（如b）的片段，而熱帶種和大莖野生種則在此處無擴增片段，命名為RSp16。2.2克隆片段pucm-t和pcr檢測從S418及S1367的RAPD擴增產物中回收RSp2、RSp5、RSp6、RSo13及RSp165個RAPD標記特異片段，分別克隆于pUCm-T載體（上海生工產）中。克隆片段的檢測采用PCR檢測法（用各標記分析中的選擇性擴增引物檢測）。經測序后，采用NCBI網站提供的BLAST2sequences軟件工具分析，獲得這5個片段的全長序列，并且RSp2片段長度為439bp,RSp5片段長度為566bp,RSp6片段長度為678bp,RSo13片段長度為971bp,RSp16片段長度為706bp。2.3甘蔗母種的rapd標記轉換為scar標記的建立2.3.1scar引物篩選用Primer3在線引物設計軟件，在RSp2、RSp5、RSp6、RSo13及RSp16的全序列片段兩端適當位置設計合成了SCAR引物共15對（表2）。其中RSp2的特異SCAR引物4對（表2,ZT51～ZT53、ZT55）,RSp5的特異SCAR引物4對（表2,ZT56～ZT59）,RSp6的特異SCAR引物2對（表2,ZT60～ZT61）,RSo13的特異SCAR引物3對（表2,ZT40～ZT42）及RSp16的特異SCAR引物2對（表2,ZT43～ZT44）。對合成的SCAR引物以12份親本種基因組為模板進行SCAR引物特異性篩選。結果見表3及圖3。從表3及圖3中可知，在由甘蔗親本種特異RAPD標記轉化成SCAR標記設計的15對引物中，2對為甘蔗屬特異引物，2對無擴增條帶，6對為多態性引物，5對為割手密種特異引物，在特異引物篩選時均獲得預期的結果，即在ZT51、ZT52、ZT53及ZT55對10個甘蔗親本種模板DNA特異擴增時，只在割手密種中有唯一的439bp條帶，而在其它8份親本種中未見有擴增條帶。這表明RSp2這一甘蔗割手密種特異的RAPD標記已成功轉化成甘蔗割手密種特異SCAR標記。2.3.2甘蔗栽培品種的分子檢測用甘蔗割手密種特異的RAPD標記RSp2成功轉化的甘蔗割手密種特異SCAR引物ZT51和ZT52分別對96份甘蔗種質（表1）進行了SCAR檢測。檢測結果見圖4。從圖4可見，RSp2這一甘蔗割手密種特異的RAPD標記已成功轉化成甘蔗割手密種特異SCAR標記。ZT51與ZT52均為RAPD標記轉化的割手密種特異引物，是根據割手密種特異的RAPD標記片段Rsp2(439bp）的測序結果設計的2對特異引物，能在崖城割手密、印度割手密及部分云南割手密親本種中特異檢測出特異標記。用ZT51引物對39份甘蔗親本種和57份甘蔗栽培種進行特異PCR檢測，該引物能在崖城割手密、印度割手密、華南割手密及大部分云南割手密親本種中特異檢測出，并在47份甘蔗栽培種上檢測出特異標記條帶，一個長度為439bp的割手密種特異DNA序列（圖4,A）。通過對這47份種質系譜的追溯，發現為含有割手密血緣的2～4物種血緣的甘蔗栽培品種（品系），其中包括閩糖70-611，故該長度為439bp的割手密種特異DNA序列，可作為有效鑒定現代甘蔗栽培品種（品系）是否含有割手密血緣的特異標記片段，記為ZT51-439，為顯性標記。用ZT52引物對57份甘蔗栽培種進行特異PCR檢測，只能在1份甘蔗栽培種（閩糖70-611，第76號）上檢測出1條長度為439bp的特異標記條帶，命名為ZT52-439（圖4,B）。從系譜圖可知閩糖70-611是由CP49-50與F134的F1代，而CP49-50是由CP34-120與Co356雜交而育成，F134是由Co290與POJ2878雜交而育成的，閩糖70-611是含有熱帶種、印度種及割手密種三血緣的栽培種，故甘蔗割手密種特異SCAR標記檢測結果從分子水平證明了這一點。應用由RAPD標記轉化的割手密種特異DNA序列ZT52-439，可有效地將閩糖70-611與其它的栽培品種（品系）區別、鑒定出來，并且均為顯性標記。3rapd標記pcr和scar引物篩選甘蔗祖親種特異DNA序列的研究，目前，國內外學者用其它方法也只從甘蔗屬及其近緣屬中找到屬的特異DNA序列。BesseandMcIntyre(1998）分離出4個對蔗茅屬具有特異性的DNA重復序列，以此為蔗茅屬的特異探針進行Southern雜交，可以用于鑒定該屬的種質，及檢測蔗茅屬與甘蔗屬的雜種基因組構成。Alixetal.（1998）從蔗茅屬的基因組DNA分離出了一個長371bp的蔗茅屬特異衛星DNA序列。Alixetal.（1999）用Alu-PCR法在甘蔗屬及其近緣的蔗茅屬和芒屬（Miscanthus）中擴增并分離出屬特異的似Alu片段，用其作探針或轉化為特異PCR引物對時，均能鑒定出各自的屬。莊南生等（2004）在進行甘蔗種質遺傳基礎的AFLP分析與種屬特異探針的研究中，篩選出了5個甘蔗屬特異探針及2個斑茅特異探針，這些特異探針可用于斑茅與甘蔗屬的雜種鑒定。Selvietal.（2003）應用玉米SSR標記對甘蔗遺傳多樣性進行研究時，獲得了能區別甘蔗屬與蔗茅屬的屬特異DNA片段及一個長度為380bp的印度種的特有片段。曾華宗等（2003）采用RAPD技術分析甘蔗種質間的親緣關系，發現某些甘蔗親本種質具有特異RAPD標記帶3個，但尚未進行特異PCR研究。本研究在甘蔗種質中利用甘蔗祖親種RAPD標記的SCAR轉化分析技術，獲得了5個甘蔗親本種RAPD標記特異片段，根據這5個RAPD標記特異片段測序結果設計的15對SCAR標記引物經特異引物篩選，篩選了一批甘蔗屬特異及甘蔗割手密種特異的SCAR引物。這些割手密種特異的SCAR引物在鑒定含割手密種血緣雜交種上已證明是有效的。本研究尚有部分特異序列未能成功轉化成特異SCAR，如從RAPD標記中回收的RSo13片段，原為熱帶種和大莖野生種兩物種特異片段，經SCAR轉化后卻表現為甘蔗屬特異或多態性；原為云南割手密種特異片段RSp6，經SCAR轉化后也表現為多態性。這與夏得安等（2008）進行與白樺纖維長度顯著相關的特異ISSR標記向SCAR標記轉化時，發現其SCAR標記的轉化率低是一致的。這可能是由于轉化成SCAR時，引物退火溫度尚未達到最佳的結果。近年來，已有很多RAPD標記成功轉化為SCAR標記的例子（ParanandM