實驗一慣用玻璃器皿的清洗及包扎一.目的與規定熟悉微生物實驗所需多種慣用器皿的名稱和規格。學會對的的清洗玻璃器皿的辦法和包扎辦法二.原理為了包裝實驗順利進行，規定把實驗用器皿清洗干凈，保持滅菌后無菌狀態，需要對培養皿、吸管等進行妥善包扎，試管和三角瓶要做棉塞。清洗辦法根據實驗目的、器皿的種類、所盛放的物品、洗凈劑的類別和沾污程度等的不同而有所不同，不同的器皿包扎辦法也不同。三.材料與儀器（一）慣用的多種玻璃器皿。（二）洗滌工具和去污粉、肥皂、洗滌液。四.操作環節（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗新購置的玻璃器皿均含有游離堿，故應先將其浸于洗液或2%的鹽酸溶液中數小時，再用自來水沖洗干凈。2.用過的玻璃器皿的清洗（1）試管、培養皿、三角燒瓶、燒杯可用瓶刷或海綿沾上肥皂、洗衣粉或去污粉等洗滌劑刷洗，然后在用自來水充足沖洗干凈。經洗滌后，若內壁的水均勻分布在一薄層，表達油垢完全洗凈，若掛有水珠，則需用洗滌液（或洗液）浸泡數小時，再用自來水充足沖洗，洗滌干凈的器皿倒置與鐵絲框內或有空心格子木架上，室內晾干。（2）玻璃吸管、滴管普通用完后應立刻用清水和蒸餾水浸泡（或沖洗），免得干燥后難以沖洗干凈，如附有污物可用洗液浸泡。（3）載玻片與蓋玻片帶有油污的應擦去有無后用熱乙醇、丙酮、二甲苯等溶液浸泡10~15min，溶液油垢然后用水沖洗，再用洗滌液浸泡、沖洗，干后置于95%乙醇中保存備用。（二）玻璃器皿的包扎1.培養皿慣用舊報紙或牛皮紙包緊，普通以5~10套培養皿作一包。包好后進行干熱或濕熱滅菌，如將培養皿放入金屬（不銹鋼）筒內進行熱滅，則不必用紙包。2.試管和三角瓶試管管口和三角瓶都需要塞以棉花塞（或泡膜塑料塞），棉花塞的作用是起過濾作用，避免空氣中的微生物進入試管或三角瓶。棉花塞的制作規定使用棉花塞緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，不能過緊也不能過松，長度不少于管口直徑的二倍，約2/3塞進管口。若干支試管用繩扎在一起，在棉塞部分外包裹牛皮紙或2層舊報紙，再扎好。三角瓶每個單獨用牛皮紙或舊報紙包扎棉塞。3.吸管洗凈烘干后的吸管，在口吸的一端月0.5cm處，用尖頭鑷子或針塞入少量脫脂棉，以免使用時將雜菌吹入其中，或不慎將微生物吸出管外，棉花要塞得松緊恰當。然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙的近左端，以45度左右的角度螺旋形卷起來，右端多出的報紙大一小結，不使散開。五、實驗報告（一）成果檢查實驗效果（二）思考題1.能否用橡皮塞、木塞來替代棉塞，為什么？2.玻璃器皿清洗時應注意什么？實驗二普通光學顯微鏡的構造和使用一、 目的與規定（一） 學習普通光學顯微鏡的構造、部分功效及使用辦法。（二） 學習并掌握油鏡的原理的使用辦法。二、 原理普通光學顯微鏡由機械裝置和光學系統2大部分構成。在光學系統中物鏡的性能最為核心，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學顯微鏡中配備的幾個物鏡以油鏡的放大倍數最大，與其它物鏡相比，使用較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，以增加照明亮度和提高分辨率。三、 材料與儀器（一）菌種金黃色葡萄球菌及枯草桿菌染色玻片標本，啤酒酵母水浸片。（二）其它香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。四、操作環節（一）顯微鏡的安置置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿3~4cm，鏡檢時姿勢要端正。（二）調節光源安裝在鏡座內的光源燈可通過調節電壓以獲得適宜的照明亮度，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應根據光源的強度及所用物鏡的放大倍數選用凹面或平面反光鏡并調節其角度，使視野內的光線均勻，亮度適宜。（三）低倍鏡觀察將標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器使觀察對象處在物鏡的正下方，下降10×物鏡，使其靠近標本，用粗調節器（粗調螺旋）慢慢升起鏡筒，出現圖像后，再用細調節器（細調螺旋）調節圖像至清晰。通過標本夾推動器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到適宜目的物，認真觀察。（四）高倍鏡觀察在低倍鏡下找到適宜的觀察目的并將其移至視野中心后，轉動物鏡轉換器將高倍鏡移至工作位置，對聚光器光圈及視野亮度進行適宜調節后微調細調節器使物象清晰，運用推動器移動標本認真觀察并統計。（五）油鏡觀察在低倍鏡或高倍鏡下找到要觀察的樣品區域后，用粗調節器將鏡筒升高約2cm，然后在待觀察區域滴加1~2滴香柏油，將油鏡轉到工作位置，從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接，將聚光器升至最高位置并開足光圈，用粗調節器將鏡筒漸漸上升，直至視野中出現物象并用細調節器使其清晰為止。（六）顯微鏡用后解決1.上升鏡筒，取下載玻片。2.用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后擦鏡紙蘸少量二甲苯擦去鏡頭上的殘留的油跡，然后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。3.用擦鏡紙清潔其它物鏡和目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。4.將各部分還原，反光鏡垂于鏡座，將物鏡轉成“八字形“再向下旋，同時把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發生碰撞危險。五、實驗報告（一）成果分別繪出在不同物鏡下觀察到的不同菌種的形態，同時注明放大倍數。（二）思考題1.油鏡與普通物鏡在使用辦法上有何不同？應特別注意什么？2.顯微鏡中調節光線強弱的裝置有哪些？實驗三酵母菌形態觀察一、 目的與規定觀察酵母菌的形態及出芽繁殖方式。二、 原理大小普通比細菌大幾倍甚至于十幾倍，大多數的酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的二分裂繁殖。用美蘭支制成的水浸片，可觀察酵母的形態和出芽繁殖方式以及進行死活細胞的鑒別（染成藍色的為死細胞，無色的為活細胞）、三、 材料與儀器（一） 啤酒酵母，假絲酵母，漢遜酵母。（二） 顯微鏡，載玻片，蓋玻片，接種針，酒精燈。（三） 呂氏美藍染液。四、 操作環節（一） 在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作接種環挑取少量酵母菌體放于美藍液中，混合均勻。（二） 取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產憤怒泡），使其蓋在菌液上，將多出菌液用吸水紙吸干。（三） 將蓋玻片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態和出芽狀況，并根據顏色來區別死活細胞。（四） 染色約0.5h后再進行觀察，注意四細胞數量與否增加。五、 實驗報告(一) 成果繪圖闡明你所觀察到的酵母形態特性。(二) 思考題1. 在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特性區別于普通細菌？2. 酵母水浸片制作室應注意什么？實驗十三培養基的制備一、 目的與規定(一) 學習制備培養基的基本技術。(二) 制備牛肉膏蛋白瓊脂培養基。二、 原理牛肉膏蛋白培養基時一種應用最廣泛和最普通的細菌培養基，這種培養基中含有普通細菌生長繁殖所需要的最基本的營養物質，可供繁殖之用。制作固體培養基時須加2%瓊脂，培養細菌時，應用烯酸或稀堿將PH調至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.4~7.6.三、 材料與儀器（一） 試劑牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二） 其它試管，三角燒杯，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。四、 操作環節(一) 稱量根據用量按比例依次稱取多種成分，牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要快速。(二) 溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐個加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需要不停攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好后，局限性所需水分。(三) 調PH用1mol/LNaoH把pH調至所需范疇。(四) 過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗成果的觀察，如無特殊規定時可省去此環節。(五) 分裝按實驗規定，可將配備的培養基分裝入試管內或三角瓶內，分裝裝置如實驗圖-8所示：分裝時注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引發污染。1．液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，普通以不超出三角瓶容積的1/2為宜。2．固體分裝分裝試管，其裝量不超出量筒的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超出管長的1/2。分裝三角瓶，以不超出容積的1/2為宜。3.半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝（六）加棉塞分裝完畢后，在試管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以制止外界微生物進入培養基而造成污染，并確保有良好的通氣性能。（七）包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。（八）保存滅菌后的培養基放入37℃培養箱中培養24h，以檢查滅菌的效果，無污染方可使用。五、實驗報告（一）成果闡明你配備培養基過程中的狀況。（思考題）1. 培養基配備時應注意什么問題？為什么？2. 分裝培養基時為什么要使用彈簧夾？3. 培養基配好后，為什么要立刻滅菌？實驗四干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌一、 目的與規定二、 原理干熱滅菌時運用高溫使微生物細胞內的蛋白凝固變形而達成滅菌的目的，細胞內的蛋白質凝固性與其我省的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固越塊，反之含水量越小，則凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160~170℃），時間長（1~2h）.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一種密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰產生蒸汽，水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續溫度，造成菌體蛋白質凝固變形而達成滅菌的目的。普通培養及用0.1MPa(相稱于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。15~30min可達成徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體狀況而有所變化。三、 材料與儀器吸管，培養皿，試管，電熱干燥箱，手提式高壓滅菌蒸汽滅菌鍋，牛肉膏蛋白胨培養基、蒸餾水。四、 操作環節（一） 干熱滅菌法，合用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養基不合用。1. 將包好的待滅菌物品（培養皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留一定間隙），管好箱門。2. 接通電源，打開排氣孔，使箱內濕空氣能逸出，旋動恒溫調節器，保持加熱升溫狀態，至箱內達成100℃時關閉排氣孔。3. 當溫度升到160~170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。4. 切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未將至70℃以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降造成玻璃器皿炸裂）、（二） 高壓蒸汽滅菌1. 首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。2. 放回內層鍋，并裝入待滅菌物品（內裝培養基或小的三角瓶），不要裝的太擠，以免妨礙蒸汽流通過影響滅菌效果，三角瓶口部要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，旋緊。3. 打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋的冷空氣，待冷空氣排盡后，關上排氣閥讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐步上升，當鍋內達成所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。普通滅菌采用121攝氏度保存20-30分鐘。4. 停止加熱，待壓力表的壓力至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。注意，當壓力不為零時，不能開蓋取物，否則由于壓力忽然下降，容器內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發生污染，甚至灼傷操作者。5. 高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構，不得隨意調節。五、 實驗報告（一） 成果檢查滅菌與否徹底。（二） 思考題1. 干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為什么？2. 為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高?3. 高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內的冷空氣？實驗十七微生物的平板菌落基數法一， 目的與規定掌握用平板菌落計數法來測定一定數量樣品中微生物細胞數目。二， 原理平板菌落計數法是通過將樣品制成一系列不同的稀釋液，使樣品中微生物個體分散成當個細胞狀態。再取一定量的稀釋液接種，使其均勻分部于培養皿中培養基上。培養后統計菌落數目，普通認為每一種菌落是由一種細胞增殖后形成，因此可計算出樣品的含菌量。三， 材料與儀器（一） 樣品，無菌水。（二） 培養基普通營養瓊脂培養基。（三） 培養皿，恒溫培養箱等。四， 實驗環節（一） 樣品解決1，在無菌的條件下，精確稱取10g固體樣品或量取10mL 液體樣品。2將10g固體樣品快速倒入已滅菌的裝有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，充足振蕩15—30min,制成稀釋10倍的菌懸液，10ml液體樣品依稀釋10倍。3，用1支試管吸取1mL稀釋10倍的菌液，加入第一支有9ml無菌水的試管中，搖勻后得稀釋100倍的菌液。換用一支試管依次稀釋到103、10……10、10倍，稀釋程度以樣品中可能含有的活菌數多少而定。（制平板）1.混合平板培養計數法上述樣品稀釋好后，用吸管取適宜稀釋倍數的樣品稀釋液1mL,放入已滅菌的培養皿中，再快速倒入約15mL融化而冷卻至50℃左右的瓊脂培養基，將培養皿按順、反時針方向旋轉搖動，使樣品稀釋液和培養基混勻，放平，冷卻凝固后倒轉放置，在被測微生物最適溫度下培養（每一種稀釋樣品各做三個培養皿），當出現菌落后，用計數器進行計數。2.涂抹平板培養計數法先將融化并冷卻至50℃左右的15ML瓊脂培養基注入已滅菌的培養皿中。放平冷卻凝固后，將不同稀釋度的樣品液0.2mL于培養皿中央，并用玻璃棒均勻地涂抹在平板表面，同意濃度可用一種玻璃棒持續涂抹。否則，需滅菌后再用。涂抹后的培養皿，暫放幾小時，待稀釋液中的水分干后將培養皿倒置保溫培養，菌落長出后，用計數器進行計數。五、實驗報告（一）成果2.計算混合平板培養計算公式：每克樣品菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數X稀釋倍數涂抹平板培養計算公式：每克樣品菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數X稀釋倍數X5（思考題）平板技術法的優缺點是什么？AYUI;09RAqweLO6EZSGD3A5RTG實驗五酵母菌形態觀察目的與規定觀察酵母菌的形態及出芽繁殖方式。原理大小普通比細菌大幾倍甚至于十幾倍，大多數的酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的二分裂繁殖。用美蘭支制成的水浸片，可觀察酵母的形態和出芽繁殖方式以及進行死活細胞的鑒別（染成藍色的為死細胞，無色的為活細胞）、材料與儀器啤酒酵母，假絲酵母，漢遜酵母。顯微鏡，載玻片，蓋玻片，接種針，酒精燈。呂氏美藍染液。操作環節在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作接種環挑取少量酵母菌體放于美藍液中，混合均勻。取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產憤怒泡），使其蓋在菌液上，將多出菌液用吸水紙吸干。將蓋玻片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態和出芽狀況，并根據顏色來區別死活細胞。染色約0.5h后再進行觀察，注意四細胞數量與否增加。實驗報告成果繪圖闡明你所觀察到的酵母形態特性。思考題在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特性區別于普通細菌？酵母水浸片制作室應注意什么？實驗十三培養基的制備目的與規定學習制備培養基的基本技術。制備牛肉膏蛋白瓊脂培養基。原理牛肉膏蛋白培養基時一種應用最廣泛和最普通的細菌培養基，這種培養基中含有普通細菌生長繁殖所需要的最基本的營養物質，可供繁殖之用。制作固體培養基時須加2%瓊脂，培養細菌時，應用烯酸或稀堿將PH調至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.4~7.6.材料與儀器試劑牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL其它試管，三角燒杯，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。操作環節稱量根據用量按比例依次稱取多種成分，牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要快速。溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐個加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需要不停攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好后，局限性所需水分。調PH用1mol/LNaoH把pH調至所需范疇。過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗成果的觀察，如無特殊規定時可省去此環節。分裝按實驗規定，可將配備的培養基分裝入試管內或三角瓶內，分裝裝置如實驗圖-8所示：分裝時注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引發污染。1．液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，普通以不超出三角瓶容積的1/2為宜。2．固體分裝分裝試管，其裝量不超出量筒的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超出管長的1/2。分裝三角瓶，以不超出容積的1/2為宜。3.半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝（六）加棉塞分裝完畢后，在試管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以制止外界微生物進入培養基而造成污染，并確保有良好的通氣性能。（七）包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。（八）保存滅菌后的培養基放入37℃培養箱中培養24h，以檢查滅菌的效果，無污染方可使用。五、實驗報告（一）成果闡明你配備培養基過程中的狀況。（思考題）培養基配備時應注意什么問題？為什么？分裝培養基時為什么要使用彈簧夾？培養基配好后，為什么要立刻滅菌？實驗十三干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌目的與規定原理干熱滅菌時運用高溫使微生物細胞內的蛋白凝固變形而達成滅菌的目的，細胞內的蛋白質凝固性與其我省的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固越塊，反之含水量越小，則凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160~170℃），時間長（1~2h）.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一種密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰產生蒸汽，水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續溫度，造成菌體蛋白質凝固變形而達成滅菌的目的。普通培養及用0.1MPa(相稱于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。15~30min可達成徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體狀況而有所變化。材料與儀器吸管，培養皿，試管，電熱干燥箱，手提式高壓滅菌蒸汽滅菌鍋，牛肉膏蛋白胨培養基、蒸餾水。操作環節干熱滅菌法，合用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養基不合用。將包好的待滅菌物品（培養皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留一定間隙），管好箱門。接通電源，打開排氣孔，使箱內濕空氣能逸出，旋動恒溫調節器，保持加熱升溫狀態，至箱內達成100℃時關閉排氣孔。當溫度升到160~170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未將至70℃以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降造成玻璃器皿炸裂）、高壓蒸汽滅菌首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。放回內層鍋，并裝入待滅菌物品（內裝培養基或小的三角瓶），不要裝的太擠，以免妨礙蒸汽流通過影響滅菌效果，三角瓶口部要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。用電爐或其它辦法加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋的冷空氣，待冷空氣排盡后，關上排氣閥讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐步上升，當鍋內達成所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。停止加熱，待壓力表的壓力至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。注意，當壓力不為零時，不能開蓋取物，否則由于壓力忽然下降，容器內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發生污染，甚至灼傷操作者。高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構，不得隨意調節。實驗報告成果檢查滅菌與否徹底。思考題干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為什么？為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高?高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內的冷空氣？實驗十七微生物的平板菌落基數法一， 目的與規定掌握用平板菌落計數法來測定一定數量樣品中微生物細胞數目。二， 原理平板菌落計數法是通過將樣品制成一系列不同的稀釋液，使樣品中微生物個體分散成當個細胞狀態。再取一定量的稀釋液接種，使其均勻分部于培養皿中培養基上。培養后統計菌落數目，普通認為每一種菌落是由一種細胞增殖后形成，因此可計算出樣品的含菌量。三， 材料與儀器（一） 樣品，無菌水。（二） 培養基普通營養瓊脂培養基。（三） 培養皿，恒溫培養箱等。四， 實驗環節（一） 樣品解決1，在無菌的條件下，精確稱取10g固體樣品或量取10mL 液體樣品。2將10g固體樣品快速倒入已滅菌的裝有玻璃珠和90mL無菌水的三角瓶中，充足振蕩15—30min,制成稀釋10倍的菌懸液，10ml液體樣品依稀釋10倍。3，用1支試管吸取1mL稀釋10倍的菌液，加入第一支有9ml無菌水的試管中，搖勻后得稀釋100倍的菌液。換用一支試管依次稀釋到103、10……10、10倍，稀釋程度以樣品中可能含有的活菌數多少而定。（制平板）1.混合平板培養計數法上述樣品稀釋好后，用吸管取適宜稀釋倍數的樣品稀釋液1mL,放入已滅菌的培養皿中，再快速倒入約15mL融化而冷卻至50℃左右的瓊脂培養基，將培養皿按順、反時針方向旋轉搖動，使樣品稀釋液和培養基混勻，放平，冷卻凝固后倒轉放置，在被測微生物最適溫度下培養（每一種稀釋樣品各做三個培養皿），當出現菌落后，用計數器進行計數。2.涂抹平板培養計數法先將融化并冷卻至50℃左右的15ML瓊脂培養基注入已滅菌的培養皿中。放平冷卻凝固后，將不同稀釋度的樣品液0.2mL于培養皿中央，并用玻璃棒均勻地涂抹在平板表面，同意濃度可用一種玻璃棒持續涂抹。否則，需滅菌后再用。涂抹后的培養皿，暫放幾小時，待稀釋液中的水分干后將培養皿倒置保溫培養，菌落長出后，用計數器進行計數。五、實驗報告（一）成果2.計算混合平板培養計算公式：每克樣品菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數X稀釋倍數涂抹平板培養計算公式：每克樣品菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數X稀釋倍數X5（思考題）平板技術法的優缺點是什么？實驗二普通光學顯微鏡的構造和使用目的與規定學習普通光學顯微鏡的構造、部分功效及使用辦法。學習并掌握油鏡的原理的使用辦法。原理普通光學顯微鏡由機械裝置和光學系統2大部分構成。在光學系統中物鏡的性能最為核心，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學顯微鏡中配備的幾個物鏡以油鏡的放大倍數最大，與其它物鏡相比，使用較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，以增加照明亮度和提高分辨率。材料與儀器（一）菌種金黃色葡萄球菌及枯草桿菌染色玻片標本，啤酒酵母水浸片。（二）其它香柏油、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙。四、操作環節（一）顯微鏡的安置置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿3~4cm，鏡檢時姿勢要端正。（二）調節光源安裝在鏡座內的光源燈可通過調節電壓以獲得適宜的照明亮度，而使用反光鏡采集自然光或燈光作為照明光源時，應根據光源的強度及所用物鏡的放大倍數選用凹面或平面反光鏡并調節其角度，使視野內的光線均勻，亮度適宜。（三）低倍鏡觀察將標本玻片置于載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器使觀察對象處在物鏡的正下方，下降10×物鏡，使其靠近標本，用粗調節器（粗調螺旋）慢慢升起鏡筒，出現圖像后，再用細調節器（細調螺旋）調節圖像至清晰。通過標本夾推動器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到適宜目的物，認真觀察。（四）高倍鏡觀察在低倍鏡下找到適宜的觀察目的并將其移至視野中心后，轉動物鏡轉換器將高倍鏡移至工作位置，對聚光器光圈及視野亮度進行適宜調節后微調細調節器使物象清晰，運用推動器移動標本認真觀察并統計。（五）油鏡觀察在低倍鏡或高倍鏡下找到要觀察的樣品區域后，用粗調節器將鏡筒升高約2cm，然后在待觀察區域滴加1~2滴香柏油，將油鏡轉到工作位置，從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接，將聚光器升至最高位置并開足光圈，用粗調節器將鏡筒漸漸上升，直至視野中出現物象并用細調節器使其清晰為止。（六）顯微鏡用后解決1.上升鏡筒，取下載玻片。2.用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后擦鏡紙蘸少量二甲苯擦去鏡頭上的殘留的油跡，然后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。3.用擦鏡紙清潔其它物鏡和目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。4.將各部分還原，反光鏡垂于鏡座，將物鏡轉成“八字形“再向下旋，同時把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發生碰撞危險。五、實驗報告（一）成果分別繪出在不同物鏡下觀察到的不同菌種的形態，同時注明放大倍數。（二）思考題1.油鏡與普通物鏡在使用辦法上有何不同？應特別注意什么？2.顯微鏡中調節光線強弱的裝置有哪些？實驗五酵母菌形態觀察一、 目的與規定觀察酵母菌的形態及出芽繁殖方式。二、 原理大小普通比細菌大幾倍甚至于十幾倍，大多數的酵母以出芽方式進行無性繁殖，有的二分裂繁殖。用美蘭支制成的水浸片，可觀察酵母的形態和出芽繁殖方式以及進行死活細胞的鑒別（染成藍色的為死細胞，無色的為活細胞）、三、 材料與儀器（一） 啤酒酵母，假絲酵母，漢遜酵母。（二） 顯微鏡，載玻片，蓋玻片，接種針，酒精燈。（三） 呂氏美藍染液。四、 操作環節（一） 在干凈載玻片中央加一滴呂氏美藍染色液，以無菌操作接種環挑取少量酵母菌體放于美藍液中，混合均勻。（二） 取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下（以免產憤怒泡），使其蓋在菌液上，將多出菌液用吸水紙吸干。（三） 將蓋玻片置于載物臺上，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母的形態和出芽狀況，并根據顏色來區別死活細胞。（四） 染色約0.5h后再進行觀察，注意四細胞數量與否增加。五、 實驗報告(一) 成果繪圖闡明你所觀察到的酵母形態特性。(二) 思考題1. 在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特性區別于普通細菌？2. 酵母水浸片制作室應注意什么？實驗十三培養基的制備一、 目的與規定(一) 學習制備培養基的基本技術。(二) 制備牛肉膏蛋白瓊脂培養基。二、 原理牛肉膏蛋白培養基時一種應用最廣泛和最普通的細菌培養基，這種培養基中含有普通細菌生長繁殖所需要的最基本的營養物質，可供繁殖之用。制作固體培養基時須加2%瓊脂，培養細菌時，應用烯酸或稀堿將PH調至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養基的配方：牛肉膏0.%5蛋白胨1%NaCL0.5%pH7.4~7.6.三、 材料與儀器（一） 試劑牛肉膏，蛋白胨，Nacl，瓊脂1mol/L;NaoH1mol/LHCL（二） 其它試管，三角燒杯，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺秤。四、 操作環節(一) 稱量根據用量按比例依次稱取多種成分，牛肉膏慣用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水熔化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要快速。(二) 溶解在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，逐個加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需要不停攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好后，局限性所需水分。(三) 調PH用1mol/LNaoH把pH調至所需范疇。(四) 過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗成果的觀察，如無特殊規定時可省去此環節。(五) 分裝按實驗規定，可將配備的培養基分裝入試管內或三角瓶內，分裝裝置如實驗圖-8所示：分裝時注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引發污染。1．液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，普通以不超出三角瓶容積的1/2為宜。2．固體分裝分裝試管，其裝量不超出量筒的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超出管長的1/2。分裝三角瓶，以不超出容積的1/2為宜。3.半固體分裝裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝（六）加棉塞分裝完畢后，在試管或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），以制止外界微生物進入培養基而造成污染，并確保有良好的通氣性能。（七）包扎棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。（八）保存滅菌后的培養基放入37℃培養箱中培養24h，以檢查滅菌的效果，無污染方可使用。五、實驗報告（一）成果闡明你配備培養基過程中的狀況。（思考題）1. 培養基配備時應注意什么問題？為什么？2. 分裝培養基時為什么要使用彈簧夾？3. 培養基配好后，為什么要立刻滅菌？實驗十三干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌一、 目的與規定二、 原理干熱滅菌時運用高溫使微生物細胞內的蛋白凝固變形而達成滅菌的目的，細胞內的蛋白質凝固性與其我省的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固越塊，反之含水量越小，則凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160~170℃），時間長（1~2h）.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一種密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰產生蒸汽，水蒸氣急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續溫度，造成菌體蛋白質凝固變形而達成滅菌的目的。普通培養及用0.1MPa(相稱于15Ib/In2或1.05kg/cm2)121.5℃。15~30min可達成徹底滅菌，滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體狀況而有所變化。三、 材料與儀器吸管，培養皿，試管，電熱干燥箱，手提式高壓滅菌蒸汽滅菌鍋，牛肉膏蛋白胨培養基、蒸餾水。四、 操作環節（一） 干熱滅菌法，合用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養基不合用。1. 將包好的待滅菌物品（培養皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留一定間隙），管好箱門。2. 接通電源，打開排氣孔，使箱內濕空氣能逸出，旋動恒溫調節器，保持加熱升溫狀態，至箱內達成100℃時關閉排氣孔。3. 當溫度升到160~170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。4. 切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未將至70℃以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降造成玻璃器皿炸裂）、（二） 高壓蒸汽滅菌1. 首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相