冷凍電子斷層成像的研究現狀與發展趨勢

0膜蛋白結構解析冷凍電視法和三維重建技術在結構生物學領域的應用迅速，已取得重要進展。與X-射線晶體學和核磁共振波譜學(NMR)等傳統的測定蛋白質分子三維結構的方法相比較,它具有以下幾個方面的優勢:1)保持生物樣品的活性和功能狀態;2)無須制備晶體,特別適合難于結晶的大分子及其復合物的三維結構判定;3)結合新型的電子顯微鏡、制樣機器人等設備和技術,可以實現顯微制樣、數據收集、三維重構全過程的自動化或半自動化,為高通量、快速解析大分子及其復合物的三維結構打下基礎。利用冷凍電鏡技術進行三維重構的主要方法有:單顆粒分析(singleparticleanalysisSPA)方法,電子晶體學(electroncrystallography)方法,和電子斷層成像(electrontomography,ET)方法。其中電子晶體學方法較多用于一些膜蛋白結構的解析,其解析的結構可以達到很高的分辨率,但要得到蛋白的二維晶體仍然是一個非常具有挑戰性的工作。單顆粒分析方法適用于具有結構同一性的樣品,通過采集大量單個顆粒的二維投影圖來重構三維結構,是冷凍電鏡三維重構發展最快也是最主要的結構解析方法。利用單顆粒電鏡重構技術已經解析出了很多生物大分子、病毒以及復合物的結構,目前的最新研究成果已經可以在準原子或原子分辨率下解析具有高度對稱性的病毒分子結構,最高精度已經達到約3.3魡左右。在準原子分辨率下,許多結構上的細節都清晰呈現,并使得建立基于冷凍電鏡密度圖的獨立原子模型(denovomodelling)成為可能。對于不具有對稱性的大分子復合體,其結構解析的分辨率也在迅速提高。另外,利用單顆粒分析方法解析各種重要功能的分子機器(molecularmachine)在不同功能狀態下的結構,以及利用其進行重建結果的多變量統計分析以確定生物大分子復合物不同的構象與結構異性也是目前研究的熱點。電子斷層成像通過獲取同一區域多個角度的投影圖來反向重構所研究對象的三維結構,適合于在納米級尺度上研究不具有結構均一性的蛋白、病毒、細胞器以及它們之間組成的復合體的三維結構。與蛋白質電子晶體學和單顆粒技術相比,這種技術無需樣品顆粒具有結構同一性,也不強調樣品具有一定的對稱性。因此,雖然目前電子斷層成像所獲得的結構的分辨率(約4~10納米)不能與以上兩種技術相比,但其在研究非定形、不對稱和不具全同性的生物樣品的三維結構和功能中有著不可替代的重要作用。冷凍電子斷層成像的適用尺度非常廣泛,包括從分子水平的蛋白質,到亞細胞水平的細胞器,以至細胞水平的組織結構。它有效地填補了X-射線晶體學、核磁共振以及冷凍電鏡單顆粒分析等方法得到的高精度結構和光學顯微鏡技術得到的低分辨率的細胞整體圖像之間的空白。同時,利用冷凍電子斷層成像法在獲得體外或細胞環境下大復合體或分子機器的納米精度的三維結構后,嵌入組成這些大復合體或分子機器的各亞單元的通過X-射線晶體學、NMR或單顆粒分析等方法得到的原子分辨率結構,可以得到生理環境下重要分子機器在細胞環境中的三維空間分布以及組裝,從而為深入理解這些分子機器的相互作用機理提供重要而有益的信息。因此,電子斷層成像技術近年來在冷凍電鏡研究領域得到越來越多的關注,也被2002年《科學》雜志評為當年的十大科技突破之一。1ct成像結合成像轉色法重構三維結構的圖像,根據樣品的結構直接進入三維斷層掃描技術(tomography)是從一個物體的投影圖像重構獲得物體內部結構的技術,通過獲取同一物體的多個連續角度下的二維投影圖來反向重構它的三維結構。與醫院中使用的CT掃描類似,簡單地說,電子斷層掃描技術就是將一個物體(樣品)沿著一個與電子束垂直的軸旋轉,每旋轉一個角度,采集這個物體在相對應方向上的二維投影像,通過對這些二維投影圖的處理(相互配準),將不同角度的二維投影圖反向重構(如加權背投影等方法),獲得樣品整體三維結構的技術(圖1)。和CT成像轉動光源獲得不同角度的投影圖不同的是,ET的光源(電子束)不轉動,通過傾轉電子顯微鏡的樣品臺來得到所研究樣品的不同方向的投影。依據電鏡型號和樣品桿的不同,樣品傾轉范圍大概在±60~±80度之間。利用多角度投影的方法重構物體的三維構象的斷層掃描技術的理論基礎在幾十年前已經建立。但早期的數據收集依靠人工完成,且需要處理的數據量相對于當時的計算機處理能力而言也很龐大,因此相關工作的進展較少。近年來,隨著計算機硬件的高速發展和數據處理能力的大大增強,特別是電子顯微鏡的更新換代以及斷層成像數據的自動收集硬件和軟件方面的改良,使得電子斷層成像研究,尤其是冷凍電子斷層成像研究,取得了極大的發展,也正在成為冷凍電鏡研究中一個越來越活躍的研究領域。1.1樣品制備1.1.1電子束的物理性質和表面形貌,都可以采用化學方法進行制樣和進行樣品由于電子斷層成像較適合用于研究細胞環境下的三維結構,因此,很多的電子斷層成像的工作采用固定、包埋和切片的常規方法制備電鏡樣品。與CT掃描使用的X-射線相比,電子束能穿透的樣品厚度較小,限制了電子斷層掃描技術對大的生物樣品(如完整的真核細胞等)的研究。對電子束難以穿透的厚樣品,如細胞等,只能采用切片的方法進行制樣。常規的制樣方法包括化學固定、樹脂包埋、切片和染色等步驟。為了研究整個細胞、組織等樣品,一般使用1%~5%戊二醛作為主固定劑,利用四氧化鋨等作進一步固定后,在一系列梯度濃度的乙醇和丙酮中進行脫水以減小迅速脫水引起的結構變化。脫水后的樣品被轉移到樹脂中在60度左右進行樹脂的聚合包埋,然后進行系列切片(電子斷層成像樣品一般做成100~500nm厚度的切片),最后利用鞣酸和醋酸鈾等進行染色,送入電鏡觀察和照相。1.1.2冷凍電子斷層成像對于一些電子束能穿透的較小或較薄的樣品,如病毒、細菌,以及一些小細胞等,可以采用與單顆粒分析制樣方法相同的快速冷凍(plunge-freezing)的方法準備樣品并進行冷凍電子斷層成像研究。冷凍電子斷層成像的主要優勢是樣品接近于天然狀態,克服了由于化學固定、脫水、冷凍替代和染色等帶來的可能的假象,很好地保護了生物樣品結構的完整性。快速冷凍制樣法將保持在自然狀態緩沖液中的樣品加入覆蓋在電鏡銅網上的帶孔碳膜上,用濾紙吸去多余樣品,然后將樣品快速浸入處于液氮溫度環境的液態乙烷冷凍劑中。由于樣品層非常薄,冷卻速度很快(可達幾萬度/秒),樣品中的水會形成一種非晶態的冰,樣品分子即懸浮在這層玻璃態的冰中,保留了樣品的原始結構信息及構象狀態,并在利用液氮保持低溫的條件下送入冷凍電鏡觀察。1.1.3不同冷凍方式制備的樣品由于水是熱的不良導體,對于大的樣品(如整個細胞),冷凍能達到的深度和體積是非常有限的。雖然常規的通過化學固定、樹脂包埋、切片、染色等步驟進行制樣的方法對細胞和組織器官等的電子斷層成像也取得了許多很好的成果,但是制樣過程仍然會引起一些結構畸變,影響了樣品的結構細節。對厚樣品可以采用高壓冷凍(highpressurefreezing,利用高壓降低水的冰點使得冷凍達到更深的層次),隨后進行冷凍替代(freezesubstitute,在低溫下用有機溶劑將冷凍組織進行置換脫水),逐漸升溫后進行傳統的包埋、切片等步驟進行制樣。利用這種方法制備的樣品在結構細節的保持上可以取得較好的效果。而真正能使大細胞和組織保持天然狀態的制樣辦法是高壓冷凍并進行冷凍切片(cryo-sectioning)。但冷凍切片還是一項很具挑戰性的工作,目前只有少數的實驗室能夠達到較高的成功率。1.2電子故障圖像的三維重建過程1.2.1數據采集系統電子斷層成像的數據收集從找到合適的成像區域開始。在起始位置成像后,樣品傾轉到下一個角度,對同一區域進行成像。電子斷層成像的數據收集的大概過程如下:1)尋找(search)合適區域,一般在較低放大倍數下進行;2)調節樣品臺傾轉中心高度(eucentricity),使樣品臺傾轉時樣品維持在成像中心范圍;3)調焦(focus);4)找到同一成像區域的精確跟蹤(tracking);5)照相(exposure);6)樣品傾斜到一個更高角度后,重新找到樣品的位置中心,然后重復以上四個模式,即search、focus、tracking、exposure幾個模式交替進行。由于電子斷層方法需要對同一個區域反復成像,對樣品局部區域可能造成較大幅度的輻照損傷,因此必須嚴格控制樣品臺的精確傾轉,保持對成像區域的自動跟蹤,以及控制每次成像的電子束劑量等。為了減少對成像區域的電子輻照損傷,一般利用lowdose模式的數據采集方案:即search模式采用較低的放大倍數,而focus和tracking模式時的照相區域稍微偏離樣品中心exposure模式位置以減少對樣品的輻照。在數據收集過程中,對不同傾轉角度圖像的tracking是通過互相關運算來完成的。為了提高圖像襯度和跟蹤的準確性,可以在樣品中加入膠體金顆粒。樣品傾轉的角度范圍取決于樣品桿類型、銅網類型、感興趣區域在銅網處的位置和樣品的厚度。數據收集方式可以從0度角開始向兩端傾轉,也可以從最大負面傾斜角度開始到最大的正面傾斜角。最常見的是記錄傾斜系列范圍在±60~±70度之間,采用1~3度間隔的線性步長。為了提高缺失錐(missingwedge)附近的采樣密度,可以增大高角度位置的采樣密度,如采用Saxton方案等。目前已有一些相對成熟的自動數據采集系統,包括一些設備生產廠家提供的商業軟件,如FEI的Xplore3D,Titzs的EM-Menu等,以及一些實驗室開發的軟件如:SerialEM,UCSFTomo,TOM,Leginon等。這些程序通過控制顯微鏡的光學系統,樣品臺和CCD來自動記錄樣品在不同角度下的一系列圖像。隨著電鏡硬件以及軟件控制的日趨完善,可以在預先設定的想要照相的各個區域進行斷層成像數據的批量收集(BatchTomo),大大提高了數據采集效率,使得高通量、全自動化的電鏡斷層成像數據采集系統的成為可能。1.2.2基于標記點與互相關的圖像配準電子斷層成像三維重構要經過兩個步驟,首先是不同角度的投影圖像的配準,其次是配準后圖像的反向投影進行tomogram的三維重建。對一個傾斜系列投影的圖像進行配準是獲得高質量重構的重要基礎。圖像配準主要是計算傾轉過程中由于樣品臺等的移動使得圖像中心的移動;其次,還需對由于不完美的成像條件導致的傾轉角度,圖像自身的旋轉、扭曲以及放大倍數等進行修正。這種修正將顯著提高三維重建的質量。圖像配準有兩種最常用的方法:即基于標記點的方法與基于圖像互相關匹配的方法。基于標記點的方法是在樣品制備過程中,摻入一定大小的膠體金作為標記物,然后根據膠體金在不同角度二維投影圖中的位置對該角度投影圖的區域中心和傾轉軸取向進行優化,這種方法最常用的軟件是IMOD。有時候,金顆粒在不同角度傾轉圖像中會發生漂移,導致不能很好地配準。如果不摻入膠體金作為標記物,可以利用互相關分析來進行不同角度的投影圖的配準和優化,其中比較常用的軟件有Protomo。除了IMOD和Protomo外,還有其他一些軟件用于圖像配準,如Spider、EM3D、XMIPP、TOM等以及FEI的Inspec3D等商業軟件。1.2.3其他重建方法電子斷層圖像的三維重構是由所有配準的傾轉投影圖重新反向投影到一個3D體積中形成的。最常用的方法是加權背投影(weightedbackprojection,WBP),將每個二維投影圖像背向其記錄時的傾斜角方向投影到三維空間中,所有背投影圖像在三維空間中疊加形成樣品的三維結構。為了防止對低頻信號的過采樣,引入了一個權重濾波器進行調節。其他的重建方法包括70年代早期發表的迭代重構方法,如代數重建技術(algebraicreconstructiontechnique,ART)和聯合迭代重建技術(simultaneousiterativereconstructiontechnique,SIRT)等。迭代重構方法基于一個前提:重構樣品沿著投影角的反向投影應該與原圖像一致。據此,通過此方法將原始投影圖和重構的投影圖進行循環比較和優化。迭代方法的一個優勢是具有一致的權函數,但計算量很大,得到三維重構結果要花費很長時間,GPU和并行處理算法的采用對此有所幫助。1.2.4異壓濾波一般來說,冷凍電子斷層成像中各個二維投影圖像的信噪比都比較低,因此重構產生的cryo-tomograms的噪音也很大。所以對重建結果要進行適當的降噪處理以突出研究對象。常用的去噪處理方式包括中值濾波、非線性濾波等。其中,各項異性擴散的非線性濾波方法用得比較多,如Tomoand等軟件。為了進一步將對象從背景和噪聲中區分開,要對重建結果進行分割(segmentation),以分開對象和背景。最簡單的方法是使用手動分割,它需要用戶繪制對象和背景的邊界輪廓。分割完成后可以利用表面渲染技術(surfacerendering)對tomogram進行可視化。也有專門的軟件幫助進行該過程,其中AMIRA軟件包是用的最多的,其它的如IMOD包中也提供該功能。以下維基百科網站收集了很多以上提到的電子斷層成像數據收集、處理以及其他冷凍電鏡成像處理中會使用到的軟件。(/wiki/Software_tools_for_molecular_microscopy)。2在細胞生物學和教學中的應用顯微技術在細胞生物學的發展歷史上起著極大的促進作用。熒光顯微鏡和共焦顯微鏡為細胞生物學的發展提供了有效的途徑。近年來,綠色熒光蛋白家族以及超高分辨率的熒光顯微鏡,如PALM、STED等的發展為在細胞中定位一個特定蛋白或分子提供了非常強有力的工具,也為分子細胞生物學的發展提供了一個良好的工具。但這些光學成像工具仍然具有其局限性,比如只能一次定位少量蛋白的空間信息,空間分辨率也還有待提高。而電子斷層掃描技術可以對細胞體內以及分離出來的細胞器進行三維重構,并提供了在納米尺度范圍內對細胞器環境下蛋白質及分子機器的結構進行重構的方法,對研究自然環境下各種分子機器的結構與功能的關系、它們在細胞中的空間布局,以及精細的細胞結構等具有重要意義。過去一些年間已經利用電子斷層成像技術獲得了對于細胞生物學來說非常有價值的信息,比如線粒體、內質網和高爾基體;核孔復合物在細胞環境下的三維結構信息等;細胞骨架在細胞中的三維分布;以及抗體在細胞中的傳遞等。對于一些小的不需切片的生物對象,可以用plunge-freezing方法獲得樣品以進行冷凍電子斷層三維重構,這方面的研究有肌動蛋白、細菌和微管鞭毛等。病毒一直是冷凍電鏡的重要研究對象之一。過去的二十多年,冷凍電鏡單顆粒分析技術已經為病毒結構與功能研究提供了比較詳盡的資料,尤其是那些具有二十面體對稱性的病毒結構。與單顆粒技術相比,電子斷層掃描技術的研究對象目前主要集中在不定形多態的、在生命過程中多變的并具有重要生物功能的病毒及其復合物,如皰疹病毒、艾滋病毒[18~22]等。雖然電子斷層掃描技術所獲得的分離的病毒粒子的結構沒有單顆粒技術獲得的分辨率高,但它能解析一些沒有對稱性、在病毒生物功能中起重要作用的病毒的結構,兩種技術對病毒的結構與功能研究都起著非常重要的作用。3冷凍電子斷層成像的硬件設備我國在電子顯微學研究方面具備很好的基礎和大量的積累,但高性能冷凍電子顯微設備的缺乏對冷凍電子顯微學的開展曾經產生了很大的制約。受益于近年來國家對冷凍電子顯微學重要前景的重視和對科研投入的增多,目前國內已經擁有了包括2臺TitanKrios、1臺TecnaiF30等在內的高端冷凍電子顯微鏡研究設備,其中一些單位也建成了一流的包括Vitrobot、高壓冷凍、冷凍切片等適合冷凍電子斷層成像研究開展的設施。同時,多家研究機構也計劃或正在購置更多的冷凍電鏡設備。因此,中國已經具備了很好的契機來開展冷凍電子顯微學和電子斷層成像方面的工作。冷凍電子斷層成像的快速發展是隨著近年來電鏡設備的改進,特別是可以自動控制樣品臺的傾斜并自動獲得相應投影圖像的軟件系統而發展起來的。要進行cryo電子斷層成像,電子顯微鏡需要滿足一定的要求,加速電壓一般要在200~400kV,最好裝有場發射槍(FEG)。試樣必須可以保持在低溫條件下(-196℃)在顯微鏡下觀察。同時,要有一個可傾轉的樣品臺,電鏡內集成的可傾轉的冷凍樣品臺的穩定性和傾斜性能比外插式的cryo-holders要好。為了自動收集電子斷層傾轉系列圖像,顯微鏡要配備一臺CCD和相應的軟件控制系統。電鏡的光學系統和樣品臺的移動、樣品臺的傾轉、樣品中心成像區域的跟蹤以及成像時的調焦等都可以由相應的軟件系統控制。斷層成像通常配備2k×2k或4k×4k的CCD相機,最好能配備一個能量過濾器,可以研究更厚的冷凍樣品并過濾掉非線性彈性散射的電子提高成像質量。4e-tilt雙軸傾轉和雙軸-n-ms的電子斷層成像技術冷凍電子顯微學和電子斷層成像依然是一個年輕的學科,處于發展和完善階段,無論在理論上還是實踐上都有許多工作要做。隨著設備的改進和應用的范圍的擴大,冷凍電子斷層成像的全自動、高通量數據收集以及高效三維重構也有更為迫切的需求。因此,探討和發展新的樣品制備、數據采集、圖像處理和三維重構方法,將X-ray/NMR數據與電子斷層數據整合、擴展數據范圍、提高結構解析的分辨率,是電子斷層成像領域要解決的技術問題。1)采用更好的樣品制備方法(如高壓冷凍、冷凍替代、冷凍切片等)保持細胞或細胞器等樣品的結構細節;2)改進數據收集方法、硬件及軟件,實現冷凍電子斷層成像的自動化、高通量數據收集。如利用Double-tilt雙軸傾轉減小缺失錐(missingwedge)效應;利用Batch-tomo方法高通量收集電子斷層成像數據;提高加速電壓和采用能量