白血病小鼠模型的建立與應用

牙齦疾病是一種嚴重的血液循環疾病，其特點是骨髓和其他血液循環組織中的大量無限細胞增生，并進入周圍血液。臨床癥狀表現為骨髓、脾、肝等血液循環器官中的血液腫瘤，以及全身組織中的革蘭氏病。伴有不同程度的貧血、出血、感染和骨痛。白血病的發病率和死亡率逐年增加,居35歲以下青少年惡性腫瘤的首位。小鼠(mouse,musculus)屬哺乳綱(Mammalia)嚙齒目(Rodentia)鼠科(Muridae)動物,在遺傳學與造血系統等方面和人類十分相似,因此建立小鼠白血病模型以研究人類白血病的細胞分子生物學特性、生化免疫特征、病理生理改變、發病機制以及藥物治療和預后具有重要意義,本文就白血病小鼠模型的建立與應用現狀進行綜述。1啟動社會化模型的小鼠目前最常用于建立白血病模型的有近交系(inbredstrain)和突變系(mutantstrain)小鼠。1.1封閉式繁殖主要包括:BALB/c小鼠、C57BL小鼠、AKR小鼠、L615小鼠等。1.1.1內皮細胞器官所占比例基因型為Aabbcc,毛白色,其特征是肝、脾等富于網狀內皮細胞的器官所占與體重比值較大。BALB/c小鼠的白血病發病率雌性為12%,雄性為10%,對放射線極度敏感,常用于單克隆抗體和免疫學研究,在白血病研究中較常使用。1.1.3抗增輸注abf小鼠細胞基因突變其它近交系小鼠還有AKR和C58自發白血病小鼠。AKR小鼠最早由洛克菲勒大學隨機交配而得,后獲得“淋巴瘤病”原種,繼而選擇培育成白血病高發品系,基因型為aaBBcc,帶Thy-la基因,缺乏補體C5,容易誘發免疫耐受性,對白血病因子敏感。當AKR小鼠發育至6~9月齡時,其淋巴細胞白血病自發率為80%,多為胸腺來源的淋巴細胞白血病;C58小鼠是1921年MacDowell用AbbyLathrop的近交系雌鼠與雄鼠交配而來,基因型為aaBBCC,當其生長至6月齡后白血病的發生率>85%,多為淋巴細胞白血病。1.1.4抗高血壓藥的制備1961年由中國醫學科學院輸血和血液研究所將普通小白鼠與C57BL鼠雜交所生的子代經近親交配20代而成,基因型為aabbCC,廣泛用于抗癌藥物的篩選以及腫瘤免疫與機理的研究。在這個品系基礎上我國又陸續培育出L7212、LS783、RS615、AL771、L6565和津638等品系小鼠,主要用于淋巴細胞白血病方面的研究。1.2突變系大鼠主要包括:nude小鼠、SCID小鼠和NOD/SCID小鼠。1.2.1不同品系小鼠的nk細胞活性即裸小鼠,是1962年英國在非近交系小鼠中發現的無毛小鼠。該小鼠第11對染色體上的第Ⅶ連鎖群內裸體位點的等位基因發生純合突變,導致先天性無胸腺和T淋巴細胞功能缺陷,常用“nu”表示裸基因符號,將“nu”導入其他品系小鼠中可獲得不同的突變系,如BALB/c-nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu小鼠等。純合子裸小鼠(nu/nu)無毛,無胸腺。成年裸小鼠較普通小鼠的NK細胞活性較高,但其粒細胞數量和活性均比普通小鼠低。裸小鼠的發現為腫瘤學等的研究提供了難得的模型材料,該小鼠已成白血病研究領域中不可缺少的實驗動物之一。1.2.2小鼠染色體畸變試驗即重度聯合免疫缺陷小鼠。1983年由美國Bomsa在近交系CB-17小鼠中發現,由位于第16對染色體的Scid單個隱性基因突變所致。SCID小鼠被毛白色,體重正常,但胸腺、脾、淋巴結的重量不及正常的30%,體內T和B淋巴細胞聯合缺陷,是建立急性淋巴細胞白血病(ALL)的有效模型。1.2.3動物模型的應用即非肥胖糖尿病型重癥聯合免疫缺陷小鼠,是SCID小鼠與糖尿病小鼠的雜交產物,它不僅有SCID小鼠的V(D)J重排缺陷,還缺乏功能性NK細胞及循環補體,抗原呈遞細胞分化及功能不良,并且不發生自身免疫性糖尿病,因而是一種免疫缺陷更嚴重、更易于異種移植成功并可穩定應用的動物模型。NOD/SCID最易于建立AML模型。近年又有研究者在NOD/SCID小鼠模型的基礎上導入IL-2受體γ鏈缺失突變,建立了NOD/scidIL-2Rgamma(null)小鼠。已有報道NOD/scidIL-2Rgamma(null)鼠在人類淋巴造血系統移植和功能方面的研究與應用明顯優于普通的NOD/SCID小鼠。NOD/SCID鼠的人類血液系統腫瘤模型能夠研究造血微環境、白血病細胞的分化調控機制和潛在的治療靶點,并且建立在此平臺上的體內藥敏實驗,在指導臨床化療方案設計已顯示突出的療效,所以NOD/SCID小鼠逐漸成為血液學實驗研究的有用工具。NOD/SCID小鼠目前被認為是動物模型中用來研究淋巴造血系統移植的“金標準”。但該小鼠價格比較昂貴,不利于開展大規模的動物實驗研究。2建立出血大鼠模型的方法目前建立白血病小鼠模型的方法主要有移植小鼠腫瘤模型、自發和誘發小鼠腫瘤模型和基因修飾小鼠腫瘤模型3種。2.1移植性小鼠病變模型移植性小鼠白血病模型的建立又可分為同種移植和異種移植。2.1.1輸注白酒小鼠、輸注質骨髓染物指將可移植性腫瘤細胞移植于同系或同種動物中連續傳代而成。如小鼠白血病模型L615,先用T638病毒給新生的L615近交系小鼠皮下或腹腔接種,發生白血病后,取白血病小鼠的脾或骨髓制成單細胞懸液給正常成年L615小鼠皮下或腹腔接種,發病后再以同樣的方法在L615小鼠中連續傳代建模。該種方法的建模周期短,重復性好,移植的腫瘤細胞生物特性較穩定,故成為國內外常用的白血病動物模型復制方法之一。自體式同系動物腫瘤移植不產生排導現象,同種移植時可結合注射腎上腺皮質激素、抗腫瘤藥物和適量放射等方法,降低宿主免疫排斥反應,提高建模成功率。2.1.2在組織治療和治療小體小型中的應用指將人體或其他種屬的動物腫瘤移植到另一種屬動物身上使其存活并生長。移植性小鼠白血病模型建立首先對實驗鼠進行預處理,方法一般分為兩種,放射線照射(γ射線4.5Gy或者137Cs2.0~4.0Gy亞致死劑量全身照射)或者化療藥物腹腔注射,使小鼠的全身免疫功能受到抑制,預處理24小時后經過尾靜脈或腹腔注射1×106~2×106個瘤細胞,一般4~6周左右成模。李麗霞等通過對裸鼠腹腔注射環磷酰胺預處理,24小時后注射Nalm-6細胞,成功建立了B-ALL小鼠模型,用于藥物體內靶向殺傷的研究。Johannes等用γ射線450cGy預照射C57BL/6鼠,24小時后尾靜脈注射攜帶AML1/ETO融合蛋白的原始粒細胞成功建立了AML小鼠模型,用于研究AML的化療作用。Bertilaccio等通過皮下或靜脈注射CLL細胞系MEC1細胞到NOD/scidIL-2Rgamma鼠,建立了CLL小鼠模型,評估CLL的發生和散播。Ishikawa等用純化的人干細胞靜脈注射到NOD/scidIL-2Rgamma幼鼠尾靜脈,建立了人類造血系統惡性腫瘤老鼠模型,研究人的造血功能和免疫能力。周斌等將不同密度的人白血病細胞SHI-1注射至SCID小鼠腹腔,成功建立了M5-AML系SHI-1/SCID小鼠模型。2.2動物的家庭暴力誘發性白血病模型一般是利用致癌物質通過口服、注入、埋藏和涂抹等方式使動物發生腫瘤。主要分為自發性動物模型(spontaneousanimalmodels)和誘發性動物模型(inducedexperimentalanimalmodel)。2.2.1化學或理化方法取自動物自然發生,或由于基因突變的異常表達通過定向培育而保留下來的疾病模型。AKR自發白血病小鼠出生時即帶有致癌的RNA病毒,對藥物的治療反應類似兒童ALL。這類小鼠白血病模型的自發性腫瘤通常比用實驗方法誘發的腫瘤與人類所患的腫瘤更為相似,有利于將動物實驗結果推用到人;且其腫瘤發生的條件比較自然,有可能通過細致觀察和統計分析而發現原來沒有發現的環境的或其它的致癌因素,可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發生上的作用。但是該類方法也存在腫瘤的發生情況參差不齊,不可能在短時間內獲得大量腫瘤學材料,觀察時間可能較長,實驗耗費較大等缺陷。2.2.2誘發性動物模型:研究者通過使用理化和生物因素作用于動物,造成動物組織、器官或全身一定的損害,出現某些類似人類疾病時的功能與代謝紊亂,化學致癌劑、放射線、致癌病毒可誘發腫瘤。1951年Gross首先用AK近交系小鼠白血病組織的無細胞濾液,注射C3H近交系新生乳鼠,分離到一株可連續傳代的小鼠白血病病毒,以后其他學者又相繼從移植性腫瘤中分離出多株小鼠白血病病毒(MLV)。另外,多環碳氫化合物如二甲苯并蒽和亞硝基脲類等化學物質可誘發小鼠白血病。放射線照射也是致鼠白血病的重要因素,Hattori等以3.5Gy的γ射線照射Swiss小鼠和C57B/6小鼠,發現46%的Swiss小鼠發生B細胞淋巴瘤,50%的C57B/6鼠發生胸腺腫瘤,由此認為γ射線致癌的動物模型主要表現為白血病和胸腺淋巴瘤。誘發性動物模型制作方法簡便,重復性好,在短時間內可誘導出大量疾病模型,并能嚴格控制各種條件使復制出的疾病模型適合研究目的需要,因而在白血病研究中常用,廣泛用于藥物篩選、毒理、傳染病、腫瘤、病理機制的研究。但該模型是通過人為限定方式而產生的,多數情況下與臨床所見自然發生的疾病有一定差異,且許多人類疾病目前還不能用人工誘發的方法復制,因而又有一定的局限性。2.3基因修養大鼠狼模型基因修飾小鼠白血病模型包括轉基因小鼠和基因敲除小鼠。2.3.1bcr陽性的cml模型指通過不同方法將外源基因導入小鼠受精卵,然后產生攜帶外源基因的小鼠品系,并能通過生殖細胞將外源基因傳遞給后代的小鼠。1976年美國科學家Jaenisch等利用反轉錄病毒把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因組,建立了世界上第一個白血病轉基因小鼠系,隨后研究者將vtAT與強力霉素結合抑制四環素操縱子調控基因的時相表達,由此構建Bcr-Abl陽性的CML模型。Ohtaki等用人T細胞白血病病毒-1型(HTLV-1)基因,成功建立了轉基因小鼠。2.3.2基因型及mb-pcr檢測又稱基因打靶小鼠,是指利用外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發生重組,使之整合到預定位點上,并替代原有基因,從而改變細胞遺傳性的方法。Kawagoe等成功敲除MN1-TEL融合基因,構建成AML小鼠模型,用于研究MN1-TEL對白血病的作用機制。隨后Carella等進一步構建CBFβ-SMMHC基因敲除小鼠,研究CBFβ-SMMHC致AML發生的機制。Mercher等用OTT-MAL融合基因敲除小鼠模型,成功研究了RBP-J介導的轉錄和誘導OTT-MAL融合基因在急性巨核細胞性白血病中的作用。3干預小鼠模型的應用和前景3.1白領細胞系的建立SCID小鼠比體外培養體系為人類白血病細胞的生長提供了更為合適的環境,而作為一種“體內組織培養皿”支持人白血病細胞的繁殖,從而為白血病細胞系的建立提供了新的工具。3.2hl60細胞和內皮細胞血管生成在白血病發病機制中起著重要作用,郭海霞等靜脈注射HL60細胞和內皮細胞(EC)在NOD/SCID小鼠,14天時出現全身白血病癥狀,證明人EC可被HL60趨化至骨髓,參與局部腫瘤血管生成,此模型可用于抗白血病血管生成及實驗研究。3.3小細胞殘留血小板近年來建立了白血病干細胞的“克隆原”檢測和PCR技術檢測特異的染色體異常等方法用于微小殘留白血病的檢測。利用SCID鼠建立的白血病模型也可用于微小殘留白血病的診斷,有學者發現接種3×106~10×106個ALL復發患者的白血病前B細胞即可導致SCID鼠發生白血病,從而為診斷微小殘留白血病提出了新方法。許小平等采用攜帶綠熒光蛋白(EGFP)基因標記的小鼠多藥耐藥白血病細胞系P388/VCR-G和DBA小鼠建立了一個檢測多藥耐藥微小殘留白血病的小鼠模型,用以證實該白血病模型小鼠對環磷酰胺(Cy)敏感,有較好的藥物劑量-生存時間關系,且接種細胞的對數與Cy劑量間有良好回歸相關關系,并監測EGFP+細胞是檢測小鼠體內微小殘留白血病細胞最敏感的方法。3.4對小鼠輸注苯二醇酯活性的影響小鼠白血病模型還可以應用于移植免疫的研究。Shapira等通過建立小鼠白血病模型用以研究霉酚酸酯對淋巴因子激活的殺傷細胞活性和移植物抗白血病作用的影響,從而表明霉酚酸酯在小鼠體內不會損害移植物抗白血病作用或減弱淋巴因子激活殺傷細胞的活性。3.5新型抗癌藥物的作用譚業輝等使用L615小鼠和L651K細胞株建立了T淋巴細胞白血病小鼠模型,給予75mGy的低劑量輻射后,發現低劑量輻射具有抗淋巴細胞白血病作用。Borch等利用L1210白血病小鼠模型評估一系列新型磷酯酰胺氮芥雜環類抗癌藥體內的生物學作用和毒性作用。Zuber等通過建立AML小鼠模型后進行了化療藥物反應實驗,發現AML模型鼠化療藥物的體內反應良好。新型抗瘤藥物的體內實驗結果常不能獲得體外培養系統中的抗癌作用。因此,鼠移植白血病模型的體內藥敏實驗可對腫瘤的治療方案進行篩查,評價其體內療效,用以預測并指導臨床治療方案的選擇和設計,體內藥敏實驗的研究平臺也適于放療、內分泌、免疫、基因治療及分子靶向治療等。3.6nod-u-2rgama動力Ishikawa等將純化的人CD34+或hCD34+hCD38-臍帶血通過面靜脈移植入NOD-scidIL-2Rgamma(null)鼠,造成70%的造血細胞嵌合現象再生,持續24周,且hCD34+原代實驗小鼠骨髓移植入第二代NOD-scidIL-2Rgamma(null)鼠中也能重新形成造血作用,表明NOD-scidIL-2Rgamma(null)新生小鼠可支持人HSC的自我更新。4建人類正常造血模型目前白血病小鼠模型