動物模型在疫苗安全性評價中的應用

申請臨床純度試驗的目的是向藥物監測機構提供證明疫苗有效性的數據。通常，數據只能通過動物模型獲得。此外,動物模型在疫苗抗原的篩選、免疫機理、免疫途徑、免疫策略等方面的研究中均起重要作用。本文對用于疫苗研究的感染動物模型的建立方法,包括動物的選擇、感染劑量和感染途徑、感染結果的描述以及建立感染動物模型的制約因素等作一綜述。1.動物模型的建立建立感染動物模型的首要問題是要確保該動物模型能最大程度地反映人類疾病發生發展的規律,這就要求所選擇的動物對特定的病原體敏感,其感染途徑、發生感染的器官及疾病嚴重程度、感染的病理學模式、免疫應答模式等均應與人類感染類似,如犬狂犬病模型;靈長類痢疾﹑結核病模型;黑猩猩艾滋病、丙型肝炎模型;雪貂流感模型;豚鼠鉤端螺旋體病模型;牛/羊布氏桿菌疾病模型等。這些動物模型可以較好地模擬相應病原微生物對人類的自然感染。但有時很難尋找到一種在動物中產生與疫苗所預防的疾病極為相似或相同的癥狀,這主要是因為動物與人之間的物種差異所致。許多病原體的感染具有物種以及組織嗜性限制,如人乳頭瘤狀病毒(Humanpapillomavirus,HPV)具有嚴格的嗜人類上皮組織的特性,自然狀態下不感染任何實驗動物。在這種情況下,動物模型的建立主要應關注的是在動物體內引起與人至少有一種相似的病理過程,或者該動物對某種抗原引起與人類相似的抗體產生和T細胞免疫反應等,如豚鼠眼角結膜實驗作為痢疾菌毒力的模型;家兔小腸結扎實驗作為霍亂弧菌毒力或霍亂毒素模型;致病大腸桿菌不耐熱毒素的毒性實驗模型等。感染動物模型的建立需要對特定的病原微生物在人類及相關動物上的致病機理有充分的認識。每一種動物模型均有其優勢和限制性,因此,在多數情況下,一個較好的動物模型建立策略是綜合使用多種動物模型來進行疫苗的臨床前研究。在疫苗研究的初始階段,一般先選用嚙齒類實驗小鼠模型來研究候選疫苗的劑量、免疫途徑、毒性以及免疫效力,之后,對于有應用前景的候選疫苗,可使用更能反應人類的遠交系動物模型進一步評價候選疫苗的保護效果。1.1對小鼠細胞免疫能力的研究BALB/c(H-2d)、C57BL/6(H-2K)、CBA(H-2K)等近交系小鼠常被用于建立感染動物模型。它們具有多種優勢,是免疫學研究中應用最廣泛的動物。小鼠容易繁殖飼養,操作方便,在單次實驗中可同時對多個疫苗劑量/佐劑以及免疫途徑進行研究。此外,還有種類繁多的商業化試劑,包括多種抗小鼠淋巴細胞分化抗原﹑細胞因子以及免疫球蛋白的單抗;用于分析特異性CD8+淋巴細胞的MHCⅠ類分子的表位肽等,利用近交系小鼠有利于進行免疫接種或感染誘導的免疫應答機制等方面的研究。但近交系小鼠的局限性也十分明顯。由于它們表達數量有限的MHC基因純合子,其MHC基因的多態性受到限制,可能產生非典型的免疫應答。很多病原微生物的自然宿主不是近交系小鼠,雖然能在小鼠上實現感染,但其致病機制不能反映人體感染的情況,使得一些在小鼠模型上具有保護力的疫苗不一定在人類身上同樣具有保護效果。此外,由于許多病毒或細菌需要在小鼠身上適應,才能有效進行復制,因此小鼠模型不適于評價減毒活疫苗的有效性。1.2非生物免疫結構動物的應用遠交系動物MHC分子的表達具有多樣性,對于特定的感染,該類動物模型能產生與自然感染類似的免疫應答。與近交系小鼠模型相比,遠交系動物模型更能反映人類的情況,尤其是非人靈長類動物,其免疫系統的組織結構和生理與人類非常類似,能最大程度地模擬人類免疫系統,以進行疫苗免疫原性的研究。遠交系動物模型的局限性主要包括:可用于遠交系實驗動物的商業化試劑不多,給詳細分析這些動物模型的免疫應答機制帶來不便;非人靈長類動物的飼養費用高,且由于動物倫理限制,其使用數量受到限制。豚鼠感染結核分枝桿菌或牛型結核分枝桿菌所導致的病理學與人類相似,但與人類相比,豚鼠對肺結核不敏感。雪貂用于流感研究,貓則用于貓科免疫缺陷病毒感染,模擬HIV感染人類。以流感疫苗研究為例,甲型流感病毒的自然宿主是野禽和水鳥,除此之外,還可從馬、豬、海洋哺乳動物、貂和雪貂等哺乳動物分離到流感病毒,可見流感病毒具有很強的跨越物種限制的能力。小鼠、雪貂、獼猴以及其他非人靈長類動物等多種動物模型已應用于流感疫苗臨床前研究。小鼠模型可用于研究流感病毒的免疫保護機理。雪貂對流感病毒易感,可通過鼻內或肌注途徑感染,感染的致病機制與人類相似,因此,常被用于評價新的流感疫苗,如表達A/H3N2株HA的DNA疫苗等候選疫苗以及多個H5N1疫苗。此外,由于流感病毒能在雪貂群體中傳播,雪貂模型還可應用于研究免疫接種對于甲型流感病毒傳播的影響。與雪貂相比,非人靈長類動物的免疫系統與人類更相似,其實驗結果更能反映人類的情況。已有多個H5N1疫苗在非人靈長類動物模型上獲得很好的保護結果。豬、家禽、馬、豚鼠等也可作為模型用于流感疫苗的評價。此外,在疫苗研究的過程中,需要使用大量的實驗動物,因此,建立動物模型時還應考慮動物的來源、經濟性及操作方便等。比較理想的是動物模型感染和疾病的發生率能夠>50%,這樣即能使用較小樣本量(10～20)來評價疫苗的效力。2.自然感染的模擬使用感染動物模型評價疫苗保護效果的方式是對動物進行免疫攻毒保護試驗。試驗中感染劑量以及感染途徑均會影響攻毒保護的結果。理想的情況是,感染劑量應是對動物感染所需的最小劑量。自然感染通常是機體暴露于少量的病原微生物所致,病原體需要在宿主組織中復制才能致病。用于攻毒保護的實驗動物應模擬自然感染發生的方式。過高的感染劑量可能導致動物產生非典型的免疫應答,這樣就不能反映自然感染所致的免疫應答途徑。而感染劑量過低則不能有效建立感染。實驗動物感染的途徑也應該模擬自然感染。動物模型的感染途徑包括皮內、皮下、肌肉、靜脈、腦內、腹腔注射等。這些感染途徑可以較精確地定量感染劑量,以建立具有代表性的感染模式。自然感染常通過口腔、上呼吸道、肺、腸以及生殖道的黏膜組織感染機體。對于感染器官黏膜表面的傳染病,這可能給模擬自然感染帶來困難。對有些病原體,上述感染途徑常不能建立起具有代表性的感染方式,因此對于特定病原體的感染途徑,應進行多種感染途徑的探索,包括滴鼻、腳蹼劃痕等。3.疾病的臨床觀察和感染檢測實驗感染應遵循科赫原則,需要從被感染動物的相關組織中分離出病原體,作為實驗動物確實發生感染的證據。在一定的時間內,分離病原體并對其進行定量,可用于說明感染的嚴重程度,通過研究病理變化以及病原體在不同器官間的傳播來判斷疾病的嚴重程度。通過疾病的病理學觀察,可確定實驗感染動物的發病模式。臨床癥狀和發病率可作為動物模型建立的指標。臨床癥狀包括食欲喪失、體重減輕、腹瀉、呼吸系統癥狀、皮膚病變、行為的改變、死亡等,均可作為感染的監測指標。通常體重減輕較大(>25%)時,提示實驗動物發生了嚴重的感染。此外,還應對感染動物進行解剖,觀察感染器官的病變情況,并進行組織化學分析。感染造成模型動物死亡作為感染終點,對于疫苗效力的研究是不適當的。實驗感染的終點判定應使研究者能夠評估感染或疾病的發生及其嚴重程度。這一點在疫苗效力的評價中尤其重要,因為疫苗效力的評價需要對一個特定的疫苗是否能預防感染或疾病,或是兩者兼有作出評價。4.缺乏適宜的動物模型物種限制是構建合適動物模型的一大困難。有些病原體的宿主范圍很窄,導致很難尋找到合適的動物模型。缺乏適宜動物模型已成為制約一些疫苗研究進展的原因之一。轉基因小鼠模型以及人源化小鼠模型的出現為解決這個難題提供了選擇。4.1藥代動力學研究和致激活劑研究進展轉基因小鼠模型可用于HBV、HPV治療性疫苗等的臨床前研究。自然感染情況下,HBV只感染人和大猩猩,具有嚴格的種屬專一和肝細胞專一性。目前已建立了非復制型HBV轉基因小鼠、復制型HBV轉基因小鼠、模擬HBV感染的轉基因小鼠以及乙型肝炎轉基因小鼠。非復制型HBV轉基因小鼠是將HBV的基因片段,如乙肝病毒表面抗原、核心蛋白、e抗原等轉入小鼠建立而成;復制型HBV轉基因小鼠是將HBV基因組插入小鼠染色體或將HBV基因組插入腺病毒載體,利用腺病毒介導基因轉移建立而成;模擬HBV感染的轉基因小鼠是在尿激酶型纖溶酶原激活蛋白轉基因(uPA)/重組活化基因-2(RAG-2)基因剔除的小鼠的基礎上,將人(或土撥鼠、樹鼩)肝細胞移植建立的嵌合小鼠模型;乙型肝炎轉基因小鼠包括急性和慢性乙型肝炎兩種轉基因小鼠模型。乙肝病毒的復制和基因表達本身并無細胞毒性和造成炎癥的活性,感染所致的肝損傷是由免疫介導的,因此,一種急性乙型肝炎轉基因小鼠的建立方法是在前述轉基因模型的基礎上,通過移植表面抗原特異性細胞毒性T細胞建立而成的,或是向成體小鼠體內水動力注射乙型肝炎病毒,以模擬乙肝病毒急性感染,并誘導T細胞反應構建而成。慢性乙型肝炎的轉基因小鼠是在重癥聯合免疫缺陷(Severecombinedimmunodeficient,SCID)小鼠上建立的HBV復制型轉基因小鼠。這些轉基因小鼠在治療性HBV疫苗的研究中廣泛應用。HPV的致癌機理復雜,目前認為,宮頸癌的形成與HPV的E6和E7癌蛋白有關。可通過轉基因小鼠表達HPV的非結構蛋白作為宮頸癌的研究模型。多個研究小組已在小鼠上皮基底層以角質素14啟動子來啟動E6或E7的表達,構建了HPVK14E6、K14E7或K14E6/E7轉基因小鼠。這些轉基因小鼠經E6或E7誘導形成宮頸癌,可用于HPV治療性疫苗的前期研究。由于HIV-1不能感染小鼠,AIDS疫苗的研究一直缺乏小鼠模型。多年來的研究已經確認了一些限制HIV-1在小鼠細胞中復制的因素,包括HIV-1進入宿主細胞的受體CD4和CCR5,CyclinT1,剪接抑制因子P32等。多個研究小組已建立了研究HIV-1在體內復制能力的轉基因小鼠模型。這些轉基因小鼠由于不能持續感染HIV,目前在HIV-1疫苗研究方面的應用有限。4.2人源化小鼠模型的建立和誘導免疫反應SCID鼠外周血或淋巴器官中缺少成熟的T和B細胞,且其T、B細胞前體不能發育成具有功能的免疫細胞,只能產生少量的免疫球蛋白,因此SCID鼠不能形成獲得性免疫應答,其免疫應答主要依靠先天性免疫。因此,SCID鼠具有接受包括人在內的一定范圍物種的異種移植物的能力。這就奠定了SCID鼠可用來建立人源化小鼠模型的基礎,以用于疫苗攻毒保護效果評價。人源化小鼠模型的建立有兩種方法:一是取人胚胎的胸腺、脾、骨髓等組織,移植到SCID鼠腎被膜下或乳腺脂肪墊內建立而成,命名為SCID-hu;另一種是將成人外周血單核細胞(Peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)或臍帶血單核細胞(Cordbloodmononuclearcells,CBMCs)接種到鼠腹膜腔內建立而成,命名為Hu-PBL-SCID。由于PBMCs或CBMCs比胚胎組織更易獲得,大部分的SCID鼠免疫評價模型應用Hu-PBL-SCID,一個人源化的小鼠模型提供了獨特的模擬人體的疫苗評價體系。在SCID小鼠的基礎上,又培育了NOD/SCID小鼠和IL-2R-γcKO小鼠,前者是非肥胖糖尿病SCID小鼠,后者是IL-2受體敲除SCID小鼠,提高了SCID鼠接受異種移植物的能力。已有多個研究小組使用了人