第九章發育毒性與致畸作用掌握致畸實驗的實驗設計、程序、評價。熟悉致畸作用的毒理學特點；致畸物的評價與分級；發育毒性體外實驗。理解致畸作用的機制。重點：致畸實驗的實驗設計、程序、評價。難點：致畸實驗的實驗設計。教學提綱：1.概述：（1）發育毒理學。（2）從畸胎學到發育毒理學。2．發育毒性與致畸性：（1）基本概念和發育毒性的終點。（2）發育各階段發育毒性作用的特點。（3）母體毒性與發育毒性。（4）發育毒性的劑量-反映模式和閾值的概念3．致畸（發育毒性）作用機制。4．發育毒性和致畸作用實驗與評價:（1）動物發育毒性實驗。（2）流行病學研究和人類的證據（3）發育毒性的替代實驗。概述發育毒理學（developmentaltoxicology）重要研究外源化學物對胚胎發育、胎仔發育以及出生幼仔發育的影響及其評定，評定辦法稱為發育毒性實驗，其中重要為致畸實驗。從畸胎學到發育毒理學外源化學物或其它環境因素與機體接觸后，能夠干擾生殖發育的任何環節，并造成損害作用。另外，哺乳動物的性激素對生殖發育過程也含有調節作用，正常的生殖發育必須在激素調節作用下完畢。因另外源化學物，首先直接作用于生殖發育過程，同時又能夠通過對內分泌系統，特別是對性腺的作用，發生間接的影響。例如，男性的睪丸萎縮和多個形式的性機能減退，女性可出現痛經、月經紊亂，甚至閉經。卵細胞的受精過程也可受到某些外源化學物的干擾，出現不孕癥。另外，神經系統對內分泌功效也有調節作用，因而也可間接影響性腺功效以及生殖發育過程，即通過下丘腦-垂體-睪丸軸或下丘腦-垂體-卵巢軸兩條途徑作用于生殖發育過程。有些外源化學物與機體接觸后，還能夠引發多個類型的形態和構造的異常。例如，正在發育中的精細胞能夠出現形態畸形或數目變化，而畸形的精子往往也含有功效缺點。卵細胞受到外源化學物的損害作用后，能夠出現死亡或影響其正常受精過程，有時即使能受精，也可能出現胚胎死亡，有些胚胎即使能存活，其正常發育也受到干擾，以致胎仔（兒）出現外觀或功效異常。外觀的異常普通稱為畸形（malformation）。它是外源化學物干擾正常生育繁殖過程的一種體現，稱為致畸作用（teratogenic）。發育毒理學是在畸胎學基礎上發展起來的毒理學分支學科。但是，畸胎學，或出生構造缺點的研究，作為一種描述性的科學在有文字之前就已經存在了。四大文明古國都有畸胎的記載，最早能夠追溯到6500D.B.。那時人們相信異常的嬰兒是上天的處罰、星象的反映和將來的預兆，或者是人和動物之間雜交的成果。隨著16、17世紀生物科學的興旺發展，willianharvy于1651年提出了畸形起因于器官或構造的不完全發育的發育障礙學說，來解釋除遺傳來源以外的歷有畸形。當代實驗畸胎學開始于19世紀初，許多19和20世紀的胚胎學家，使用多個不同的物理(震動，倒置，針刺)和化學因素解決雞蛋，產生了畸形小雞，重要的是，他們注意到作用時間在決定畸形類型方面比損傷的性質更重要。反映停(thalidomide)，20世紀60年代前后在歐洲和日本廣泛作為安全有效的抗早孕反映藥品，口服劑量50—200mg／d。1961~1962年，聯邦德國的兒科病房中出現了大量罕見的短肢畸形兒，多數為四肢缺點、無眼、腭裂、骨骼發育不全、十二指腸和肛門閉鎖。同一時期，全球出現了5850個短膠畸形兒。McBride和Lenz在德國和澳洲的獨立研究，均確認反映停是其因素。反血停被迫從市場撤回，動物模型復制成功。其致畸劑量相稱于1mg／(kg.d)，只要末次月經后6~8周內口服200mg反映停便可引發嚴重的短肢畸形；服藥婦女尚有流產、早產和死胎等發生。反映停事件是人類歷史上的一種悲劇。但由此，增進了化學致畸的研究以及管理法規的建立。在許多國家中，管理機構開始發展動物測試辦法并與慢性毒性研究分開，以評定藥品對妊娠的影響。1966年美國FDA提出了三段生殖毒性實驗指南，涉及對致畸等發育毒性的評價。但是，盡管早就提出了發育毒性的四大致現，實際研究中仍將注意力放在致畸作用上，而無視了對其它發育毒性的評價。直到20世紀80年代后期美國環保局(EPA)提出可疑發育毒物危險度評價指南，第一次明確提出了對發育毒性的評價。我國每年有30—40萬患嚴重的、肉眼可識別的先天缺點的新生兒出生，其中很大比例在一年內死亡。先天畸形占圍生期死亡因素的第二、第三位。先天缺點造成壽命縮短是腫瘤和心血管疾病的8倍和5倍發育毒性與致畸性發育毒理學(developmentaltoxicology)是毒理學的重要分支學科，研究發育生物體在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的發育過程中，由于出生前接觸造成異常發育的理化因素或環境條件后的發病機制和成果。一、基本概念發育毒性(developmentaltoxicity)指出生前經父體和(或)母體接觸外源性理化因素引發的在子代達成成體之前內出現的有害作用，涉及：構造畸形、生長緩慢、功效障礙及死亡。能造成發育毒性的物質稱為發育毒物(developmentaltoxicant)。發育毒物應是在未誘發母體毒性的劑量下產生發育毒性的物質。某些外源化學物可干擾胚胎以及胎兒的發育過程，影響正常發育。具體體現可分為：1、生長緩慢：即胚胎與胎仔的發育過程在外源化學物影響下，較正常的發育過程緩慢。2、致畸作用(teratogeniceffect)：由于外源化學物干擾，活產胎仔胎兒出生時，某種器官體現形態構造異常。致畸作用所體現的形態構造異常，在出生后立刻可被發現。3、功效不全或異常：即胎仔的生化、生理、代謝、免疫、神經活動及行為的缺點或異常。功效不全或異常往往在出生后一定時間才被發現，由于正常狀況下，有些功效在出生后一定時間才發育完全。4、胚胎或胎仔致死作用：某些外源化學物在一定劑量范疇內，可在胚胎或胎仔發育期間對胚胎或胎仔含有損害作用，并使其死亡。具體體現為天然流產或死產、死胎率增加。在普通狀況下，引發胚胎或胎仔死亡的劑量較致畸作用的劑量為高，而造成發育緩慢的劑量往往低于胚胎毒性作用劑量，但高于致畸作用的劑量。以上四種發育毒性的具體體現并非一定在一種外源化學物作用下同時出現，有時只出現其中的一種或一部分。另外，有些外源化學物通過胎盤與發育中的胚胎或胎仔接觸，還能夠引發子代腫瘤發生率增高。致畸作用是外源化學物發育毒性的一種具體體現，對存活后裔機體影響較為嚴重，往往是一種不可逆過程，含有重要的毒理學意義，本節也將以致畸作用為重點，進行討論?；?malformation)：器官形態的異常。變異(variation)：集體的形態構造或生理功效，在同一物種的子代與親代之間或子代的個體之間，有時出現不完全相似的現象，即為變異?；?terate)：含有畸形的胚胎或胎仔。致畸物或致畸原(teratogen)：凡在一定劑量下，能通過母體對胚胎或胎兒正常發育過程造成干擾，使子代出生后含有畸形的化合物。致畸實驗：評定外源化學物與否含有致畸作用的實驗。畸形時胚胎或胎兒的某些細胞在生長發育的最敏感階段受損的成果。致畸作用是外源化學物毒性作用的一種體現。先天性畸形并非一定含有遺傳性，并且大多數先天畸形并不含有遺傳性，但也確有一部分先天性畸形含有遺傳性，可傳給后裔。凡由于外源化學物損傷生殖細胞所引發的先天性缺點或異常，含有遺傳性，可有親代動物遺傳給子代。如果此種損害僅涉及體細胞，與生殖無關，則所引發的先天畸形不含有遺傳性。根據現在致畸實驗的概念和辦法，涉及范疇僅限于體細胞受損所引發的畸形，即外源化學物干擾胚胎器官形成過程的成果。除外源化學物含有致畸作用外，其它物理因素（如放射線）和生物因素（如風疹病毒）也可引發胎兒畸形?，F在在毒理學中，重要以化學物的致畸作用作為研究對象。胚胎毒性作用(embryotoxicity)外源化學物引發的胎仔生長發育緩慢和功效缺點不全的損害作用。其中不涉及致畸和胚胎致死作用。二、發育各階段發育毒性作用特點器官發生期的胚胎對致畸物最為敏感含有發育毒性的外來化合物與發育中的胚胎或胎仔接觸，可因胚胎或胎仔所處的發育階段不同而呈現不同的敏感性。有性生殖動物由受精卵發育成為成熟個體的過程，可概括為胚泡形成、著床、器官發生、胎兒發育以及新生兒發育等階段。著床前的胚胎對胚胎致死作用較為易感，對致畸作用并不如此。在胚胎發育后期和新生兒期，最容易體現的發育毒性是生長緩慢和神經、內分泌以及免疫系統機能的變化。胎仔或胎兒對胚胎致死作用的易感性雖較胚胎為低，但仍有一定數目的死產胎發生。在致畸作用中，對致畸物最敏感的階段是器官發生期，普通稱為危險期或核心期。在慣用實驗動物中，自受精日計算，大鼠器官發生期約為9～17天，小鼠器官發生期為7.5～16天，家兔為11～20天。在器官發生期中，致畸物與胚胎接觸可能造成形態構造異常，但如在著床前胚泡形成階段接觸致畸物，則往往出現胚胎死亡，畸形極少。大鼠著床前胚泡形成期，自受精日計算，約為3～4天，開始著床日約為5.5～6天；小鼠分別為3～4天和4.5～5天；家兔分別為3～4天和7天。同一劑量的一種致畸物在敏感期中與胚胎接觸，可因胚胎所處發育階段不同而出現不同的畸形。例如，以20mg/kg體重劑量環磷酰胺在受精后第8～12天期間，每日分別予以小鼠，即使畸形多出現于前肢趾部，但畸形種類，則可因予以的日期不同而分別為多趾，并趾，缺趾和無趾。如將大量維生素A在受精后第8天予以大鼠，重要出現骨骼畸形；如在第12天予以，則誘發腭裂。同樣劑量砷酸鈉在小鼠受精第7天和第9天分別予以，前者重要出現臍疝，后者重要為露腦。發育中的胚胎對致畸作用的敏感期即使重要在器官發生期，但在此期間，多個不同器官還各有特別敏感的時間。大鼠器官發生期為受精后9～17天，但眼的最敏感期為受孕后9天，心臟和主動脈弓約為9～10天之間，腦約為10天，頭與脊椎骨約為11天，腭為12～13天，泌尿生殖器官約為15天。三、母體毒性與發育毒性母體毒性(maternaltoxicity)是指外源化學物在一定劑量下，對受孕母體產生的損害作用。具體體現涉及體重減輕、出現某些臨床癥伏、直至死亡。母體毒性作用可分為輕度和嚴重母體中毒。輕度母體中毒的體現應限于母體體重下降，正常增加受到克制?？酥瞥潭龋怀霾唤佑|受試物對照組動物的10%。肝重可略有增加，但生殖機能正常；嚴重母體中毒可出現體重增加大幅度克制、持久性嘔吐、過分安靜或活動過分、呼吸困難、生育機能明顯受損及其它中毒癥狀，甚至死亡。母體毒性作用與致畸作用關系外源化學物的母體毒性作用與致畸作用的關系有下列幾個：1、含有致畸作用，但無母體毒性出現。表明此種外源化學物的致畸作用品有特定的作用機理，與母體毒性無關。此種受試物致畸作用往往較強，應特別注意。2、出現致畸作用的同時也體現母體毒性。此種受試物可能既對胚胎有特定的致畸機理，同時也對母體含有損害作用，但兩者并無直接聯系。3、不含有特定致畸作用機理，但可破壞母體正常生理穩態，以致對胚胎含有非特異性的影響，并造成畸形。4、僅含有母體毒性，但不含有致畸作用。5、在一定劑量下，既不呈現母體毒性，也未見致畸作用。此種狀況較為復雜，實際有兩種可能:一種是受試物確實不含有致畸作用，并且也不含有母體毒性；另一種狀況是動物接觸的劑量未達成致畸作用的最小有作用劑量，即致畸閾劑量，并非真正不含有致畸作用。在對一種外源化學物進行致畸實驗時，如未觀察到致畸作用，也無母體毒性體現，應在動物可能耐受條件下，最大程度地增加劑量，使其遠遠高于人類實際可能接觸的水平，如仍未出現致畸作用，才可做出結論。嚴格的概念，在一定劑量下，能引發母體毒性作用，但未觀察到致畸作用，才能夠認為不含有致畸作用。母體毒性致畸作用較母體毒性作用劑量為低。四、發育毒性的劑量-反映模式和閾值的概念1、劑量效應關系復雜的體現及因素是：（1）機體在器官形成期間，與含有發育毒性的化合物接觸，能夠出現畸形，但也可引發胚胎致死。當劑量增加時，毒性作用增強，但兩者增強程度并不一定成比例，往往胚胎致死作用增強更較明顯，而致畸作用并不如此。由于胚胎死亡增加，畸胎數將因而減少。（2）某種致畸物能夠引發一定的畸形，但在同一條件下，予以更高的劑量，并不出現同一類型畸形。可能由于較高劑量往往造成較為嚴重的畸形，較低劑量普通引發的輕度畸形，而嚴重畸形有時可將輕度畸形掩蓋。例如一種致畸物在低劑量時，能夠誘發多趾，中檔劑量時則誘發肢長骨縮短，高劑量時可造成缺肢或無肢。（3）許多致畸物除含有致畸作用外，尚有可能同時出現胚胎死亡和生長緩慢；并且不同體現還能夠互相影響，又無一定規律。因此劑量效應關系更為復雜。2、致畸作用的劑量反映曲線較為陡峭最大無作用劑量與100%致畸劑量之間距離較小，普通相差1倍，曲線斜率也較大，亦即致畸帶較為狹小。往往100%致畸劑量即可出現胚胎死亡，劑量再增加，即引發母體死亡。尚有人觀察到致畸作用最大無作用劑量與引發100%胚胎死亡的最低劑量僅相差2～3倍。例如劑量為5～10mg/kg體重的環磷酰胺予以受孕小鼠不體現致畸作用，但增加到40mg／kg體重，可引發100%胚胎死亡。致畸物劑量與反映關系闡明在致畸實驗中，劑量的選擇含有重要意義。因致畸實驗重要觀察指標為活產胎仔出生時存在的畸形，因此如果胚胎或胎仔大量死亡，則影響對致畸作用的觀察，即使受試物有致畸作用，亦將被掩蓋，無法被觀察到。3、致畸作用最大無作用劑量問題尚有不同意見：普通認為機體接觸低于致畸閾劑量的致畸物時，先天畸形、胚胎致死和生長緩慢發生率的自然本底質并不增高，表明這一劑量即為最大無作用劑量。但也有人認為致畸作用中的最大無作用劑量問題并無解決，重要是現在對于低劑量致畸物的作用與畸形自然發生率的本底值，尚不能明確分辨。掌握致畸作用中劑量與效應關系的規律，對外源化學物致畸實驗中適宜劑量的擬定，含有重要意義。過低劑量局限性以顯示確實存在的致畸作用，可得出錯誤的結論；劑量過高可使大量胚胎死亡或對母體毒性作用過強，都可影響成果的對的性。另外，評定一種致畸物對人體危害時，應充足考慮人體可能實際接觸的劑量。在致畸實驗中，對此將進一步討論。致畸（發育毒性）作用機制發育的特點是在大小、生物化學和生理學、形態和功效方面的變化。這些變化受到管理基因轉錄的因素調節，這些因素在胚胎的基因組中使調節基因活動，并且持續的基因激話作用次第持續貫穿發育。現在，細胞間和細胞內對正常發育所必要的信號傳導途徑已被闡明，已知它們依賴于轉錄、翻譯，以及翻譯后(如，磷酸化作用)的調控?；瘜W毒物對發育損傷的機制十分復雜，多數還不清晰。Wilsom(1977)提出了畸形發生的9種機制，涉及突變、染色體斷裂、有絲分裂變化、變化核酸完整性或功效、減少前體或底物的補給、減少能源支持、變化膜特性、滲入壓不平衡和酶克制作用。近年來在分子水平的研究有很大的進展，即使胚胎有代償機制彌補外源性化學物的影響，但是，與否產生畸形依賴于在致病過程中的每個環節在損傷和修復之間的平衡。1、干擾基因體現某些基因的體現受到克制或異常體現可能引發畸形。如有報道在培養的小鼠胚胎中用反義寡核苷酸探針克制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，都可產生中腦和后腦，或中腦、后腦和脊髓的畸形。剔除Wnt—1基因的突變小鼠也可產生中腦和后腦的畸形。反之，如向小鼠胚胎中加人雞的β－肌動蛋白啟動子時，Hox-1.1基因體現，并產生多個顱臉部和頸椎的畸形。2、基因突變與染色體畸變已發現誘變原有潛在致畸性，如電離輻射、烷化劑、亞硝酸鹽、多數致癌物都可能致畸。實驗證明，妊娠第13天的大鼠胚胎羊膜內注入CP及其兩個代謝活化的致畸性產物PM或AC后，CP和AC引發了腦積水、露眼、腭裂、小頜畸形、臍疝、尾部和肢部缺點；而PM僅僅引發腦積水，尾部和肢部缺點。3H標記CP的實驗顯示大概87％的放射性與蛋白質結合，5％與DNA結合，8％與RNA結合。使用堿洗脫，證明CP和PM引發單鏈DNA斷裂，以及DNA-DNA和DNA-蛋白質交聯。進一步的實驗證明：PM的一種單功效烷化衍生物，有能力產生單鏈斷裂但無DNA交聯作用，引發了和PM同樣的效應譜；而PM的一種非烷化衍生物(CP類似物)和AC不引發DNA損傷。AC易與蛋白質結合，而PM易與DNA結合。PM和AC對培養中的肢芽有明顯的不同效應。這些成果提示PM和AC在胚胎中有不同的靶，PM對CP誘導的DNA損傷有責任，而AC可能通過與蛋白質結合而致畸。有報道染色體畸變占人類發育缺點因素的3％左右。這數字可能比實際低得多，由于常染色體數目的過多或缺少經常使胚胎死亡，難以發現或未作檢查。而生殖丟失占很大比例?，F在，大量的研究已證明，自發流產的胚胎中最少50％存在染色體畸變(重要是不分離)。電離輻射，病毒以及能引發染色體畸變的某些化學毒物都有致畸作用。3、損傷細胞和分子水平的翻譯細胞增殖對發育顯然是必要的。細胞增殖率在個體發生過程中空間和時間都在變化，在胚胎中細胞增殖、分化和凋亡之間有精巧的平衡。用CP解決妊娠第10天大鼠，引發胚胎的S-期細胞周期阻斷，在細胞快速增殖區域觀察到細胞死亡。細胞周期長度的不同可能部分地影響敏感性。如：胚胎的神經上皮對CP誘導的細胞死亡相稱敏感，而心臟有抵抗力。第10天大鼠胚胎神經上皮的細胞周期時間大概為9.5h，而在心臟中的細胞周期大概是13.4h，這是由于心臟細胞比神經上皮有更長的Go／Gl期。對DNA的損傷可在G1-s轉換時、S期和G2-M轉換時克制細胞周期的進展。CP誘導DNA損傷可造成細胞周期混亂和特定的細胞群體中的細胞死亡。如果DHA損傷被修復，細胞周期能恢復正常，但如果損傷太廣泛，或細胞周期克制太久，可能引發凋亡。在全胚胎培養中使用活化的CP也觀察到相似的胚胎細胞周期阻斷和細胞死亡。4、細胞調亡細胞凋亡，又叫程序性細胞死亡，指胚胎中在遺傳基因的控制之下的特定類型的細胞死亡。凋亡對來自原基的構造的造型是必需的。有不少致畸物，如細胞生長依賴激素、乙醇、抗癌藥品都能增進細胞凋亡。在凋亡中起一定作用的基因在不停增加。p53基因，有腫瘤克制基因的作用，能增進凋亡或生長停止。在正常的發育期間出現的凋亡不需要p53基因，例如，有p53-缺點的胚胎能正常發育。然而，p53可能在對DNA損傷的反映中對造成生長停止或凋亡有重要作用。如，與正常純合子(十／十)的對攝影比較，在雜合子p53缺點(P／十)妊娠小鼠的子代中，苯并[a]芘引發的胎兒吸取和產后死亡的發病率分別增加了3倍和10倍以上。生長因子和某些細胞因子(IL-3，IL-6)能防止p53-依賴的凋亡。c-myc產物的體現使DNA持續不停地合成，而面臨DNA損傷時它可能促成凋亡。Bcl-2有作為凋亡的阻遏物的功效和與類似物Bax結合的功效，Bax可與它自己或與Bcl-2成為二聚物。Bax同型二聚體促成細胞死亡，Bcl-2／Bax異型二聚體克制細胞死亡。已證明，致畸因子過高熱、環磷酰胺或砷酸鹽解決著床后的小鼠胚胎，在某些胚芽組織中與凋亡一起造成DNA斷裂、caspase-3的話化和多聚(腺甘酸二磷酸-核糖)聚合酶(PABP)的分裂。這些因子還能引發胚胎線粒體的變化而造成細胞色素C的釋放，并造成caspase-3上游的活化因子caspase-9的活化。5、干擾細胞細胞交互作用反映停的代謝活化產物引發胚胎細胞的粘連受體(adhesivereceptors)下調，妨礙發育過程中細胞與細胞和細胞與基質之間的互相作用，干擾了細胞之間的通訊從而造成肢芽構造異常。6、通過胎盤毒性引發發育毒性已知對卵黃囊或絨(毛)膜尿囊胎盤有毒性的毒物有46個，涉及鎘(Cd)、砷或汞、香煙、乙醇、可卡因、內毒素和水楊酸鈉等。如Cd在妊娠中晚期通過引發胎盤毒性(壞死，減少血流)和克制對營養物質的傳送造成發育毒性。實驗發現，在妊娠晚期大鼠體內注入Cd造成胎兒死亡，但幾乎沒有的進入胎兒體內，而是在10h內隨著子宮胎盤血流減少發生胎兒死亡；如胎兒直接注射Cd，盡管胎兒的Cd負荷比母體給藥后高幾乎10倍，胎兒死亡僅只有輕微增加。另外，Cd可在胎盤誘導金屬結合蛋白(或稱金屬硫蛋白，MT)，而MT對Zn有高親和力，可在胎盤中結合Zn而干擾Zn轉移通過胎盤。Cd的理化性質與必需元素鋅(Zn)相似，可競爭性克制人類通過胎盤微泡吸取Zn跨膜轉運，以及競爭性地在胎盤中克制其它的Zn依賴的過程。聯合予以Zn能夠改善Cd的發育毒性。7、干擾母體穩態二氟苯水楊酸，引發兔的中軸骨骼缺點。其發育毒性劑量引發嚴重的母體貧血并損耗紅細胞ATP水平。妊娠第5天給單劑量的二氟苯水楊酸引發持續到第15天的母體貧血，而這正是缺氧引發類似的中軸骨傷缺點的核心日子，胚胎中血藥濃度低于母體的血藥峰水平的5％。因此，二氟苯水楊酸對兔的致畸性或許是由于母體的貧血造成缺氧的成果。苯妥英在實驗動物中能影響母體的葉酸代謝致畸。孕第10天，易感的A／J小鼠的心率劑量依賴性地被苯妥英減少，實驗性給氧可減少小鼠中苯妥英的致畸性；而抗性的C57B1／6J小鼠心率不減少。因而認為，畸形與母體的心率減少和胚胎的缺氧有關。減少子官的血流被認為是經基脲引發致畸的一種機制，它提高收縮壓，變化心率，減少心輸出，嚴重地減少子宮的血流，并且在妊娠兔中增加血管的阻力，給藥后胚胎立刻顯示顱面和心包出血。而通過夾緊妊娠兔子宮血管10min可引發同樣的胚胎異常。MT合成可被涉及金屬、酒精、胺基甲酸乙酸、內毒素、烷化劑、高或低血糖和電離輻射等許多化學和物理因素誘導，也可被糖皮質激素和某些細胞因子等內源性調節劑誘導。MT合成的誘導可造成孕母肝MT濃度大大高于正常，減少血漿Zn濃度，進而使孕體可運用的Zn減少、Zn缺少而造成發育毒性。這已為多個不同的化學物涉及丙戊酸、6-巰基嘌呤、烏拉坦、乙醇和常春藤皂貳的實驗所證明。孕婦缺少代謝前體或基質也是致畸機制之一。膳食中某些營養素缺少，特別是維生素和無機鹽類缺少易造成生長緩慢、致畸或胚胎死亡。我國因孕期母體缺碘或新生兒期缺碘，造成的智力低下小朋友近1000萬。因此政府推廣食用加碘鹽。8、內分泌干擾作用激素含有對內環境穩定的維護和發育過程的調節作用。內分泌干擾物為干擾激素的制造、釋放、傳送、代謝、結合、作用或排除的外源性因子。涉及殺蟲劑、除草劑、殺菌劑、塑化劑、表面活化劑、有機金屬、鹵代雜環烴、植物雌激素等。由于激素在許多組織中有指導分化的核心作用，發育中的生物體對有激素或抗激素活性的化學物特別敏感。內分泌干擾物最少通過四種干擾內分泌系統的作用模式引發發育毒性：①作為類固醇受體的配體起作用；②變化類固醇激素代謝酶；③擾亂下丘腦。垂體激素釋放；④通過現在還不清晰的模式作用。典型的例子是己烯雌酚(DES)，在小鼠中造成涉及雄性和雌性生殖道和腦畸形的發育毒性。雌性子代出現不育，輸卵管、子宮、子宮頸和陰道的構造異常和卵泡的損耗和畸形3雄性子代可體現出尿道下裂，精子形態學和運動性異常，生殖道損害(涉及隱睪癥和睪丸癌)，不育等。在發育期暴露抗雄激素物質重要顯示男性異常，涉及尿道下裂，保存乳頭，睪丸和副性腺重減少，精子產生減少。發育毒性和致畸作用實驗與評價致畸作用是發育毒性中最重要的一種體現，因另外源化學物發育毒性的評定，重要是通過致畸實驗。在致畸實驗中除可觀察到出生幼仔畸形外，也可同時發現生長發育緩慢和胚胎致死。傳統常規致畸實驗是評定外源化學物與否含有致畸作用的原則辦法，數年來諸多國家和機構都采用和推薦這一辦法。一、動物發育毒性實驗1、動物選擇致畸實驗的動物選擇，除參考毒性實驗中選擇動物的普通原則，即食性和對受試物代謝過程與人類靠近，體型小，馴服，容易喂養和繁殖及價廉外，還應特別注意妊娠過程較短、每窩產仔數較多和胎盤構造及厚度與人類靠近等特點。根據上述原則綜合考慮，致畸實驗可選用二種哺乳動物，普通首先考慮大鼠，另外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高，每窩產仔8～10只，易于得到足夠標本數；并且經驗證明，大鼠對大多數外源化學物代謝過程，基本與人類近似，故可首先考慮。但大鼠對普通外源化學物代謝速度，往往高于小鼠和家兔，以致對化學致畸物耐受性強、易感性低，有時出現假陰性。大鼠在器官發生期早期，其胎盤含有卵黃囊，稱為卵黃囊胎盤，在器官發生期后期，將轉變為絨膜尿囊胎盤，有些外源化學物，例如錐蟲藍能夠干擾通過卵黃囊胎盤對胚胎的正常營養過程，并因此致畸，出現陽性成果；而人類胎盤不含有卵黃囊胎盤階段，不存在同樣問題，因此有時此種成果對人類為假陽性。小鼠自然畸形發生率較大鼠高，但低于家兔，對形成腭裂的致畸物更較敏感。家兔為草食動物，與人類代謝功效差別較大，妊娠期不夠恒定，有時延長至36天，自然畸形發生率也較高。2、劑量分組由于致畸作用的劑量效應（反映）關系曲線較為陡峭，斜率較大，最大無作用劑量與引發胚胎大量死亡以及母體中毒死亡的劑量極為靠近。因此在擬定劑量時，首先規定找出最大無作用劑量以及致畸閾劑量；同時還要保持母體生育能力，不致大批流產和過多胚胎死亡；較多母體死亡也應避免。普通應先進行預試，預試的目的是找出引發母體中毒的劑量。根據預試成果能夠擬定正式實驗劑量。應最少設3個劑量組，另設對照組。原則上最高劑量組，能夠引發母體輕度中毒，即進食量減少、體重減輕、死亡不超出10%。最低劑量組不應觀察到任何中毒癥狀；中間劑量組能夠允許母體出現某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數關系。普通最高劑量不超出LD50的1/5～1/3，低劑量可為1／100～1／30。這一原則在預試中也可試用。如已掌握或能預計人體實際接觸量，也可將實際接觸量作為低劑量，并以其10倍左右為最高劑量。凡急性毒性較強的受試物，所采用劑量應稍低，反之可較高。也有人以亞慢性毒性實驗的最大無作用劑量為高劑量，并以其1／30為低劑量，可供參考。每組動物大鼠或小鼠為12～20只，家兔8～12只，狗等大動物3～4只。在普通常規實驗中，除設有3個劑量組和一種對照組外，如受試物溶于某種溶劑或介質中予以動物，則另設溶劑對照組。有時為了更加好地驗證明驗成果。另設陽性對照組，按大鼠每kg體重15000IU維生素A劑量，或將每ml含50000IU維生素A的濃魚肝油，按每100g體重1ml劑量給大鼠灌胃。另外敵枯雙、五氯酚鈉等也可采用。致畸實驗的劑量分組，可因實驗目的的不同而異，如實驗的重要目的是先擬定受試物有無致畸作用，則組數可先對減少，但每組動物數應較多。如觀察劑量－效應關系，則組數應增加。3、動物交配解決將性成熟雌雄動物按雌雄l：1或2：1比例同籠交配。每日將已擬定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。擬定受孕辦法是陰栓檢查或陰道涂片精子檢查。出現陰栓或精子之日即為受孕0日，也有人作為第1日。精確擬定受孕日對精確掌握動物接觸受試物時間、最后處死動物及擬定進行檢查的日期非常重要。由于致畸作用有極為明確的敏感期，應精確掌握動物接觸受試物的時間，必須在器官發生期。如提前在著床前接觸，將影響受精卵的著床。如在胚胎發育的最初階段，例如裂卵期和囊胚期接觸受試物，往往可使胚胎死亡，不能造成畸形。如在器官發生期后來接觸受試物，則多個器官已發育成熟，致畸作用不易體現。只有器官發生期的胚胎，對致畸物最為敏感，易于出現畸形。大鼠和小鼠普通可自受孕后第5天開始予以受試物，每日一次，持續到第15天。如擬進一步研究何種器官對受試物更為易感，則應在上述期間將受試物每日分別予以一批動物，每批動物只接觸受試物一次，最后能夠根據畸形出現的狀況，擬定受試物的重要靶器官。接觸受試物的方式與途徑應與人體實際接觸狀況一致，普通多經口予以。也可采用灌胃方式，以確保劑量精確，效果較混入飼料喂給為好。在特殊狀況下，也可采用腹腔注射法，效果與經口近似。實驗期間每2～3天稱取母鼠體重。首先可根據體重增加，隨時調節予以受試物的劑量，同時也可觀察受孕動物的妊娠狀況和胚胎發育狀況。受孕動物的體重如持續增加，則表達妊娠過程及胚胎發育正常；如體重停止增加或下降，可能由于受試物的毒性作用或母體的其它因素，引發胚胎死亡或流產。4、胎仔檢查自然分娩前1～2日將受孕動物處死，剖腹取出子宮及活產胎仔，并另行統計死胎及吸取胎。普通大鼠在受孕后第19～20天，小鼠第18～19天，家兔在第29天?；町a胎仔取出后，先檢查性別，逐只稱重，并按窩計算平均體重，然后由下列幾方面進行畸形檢查：①外觀畸形肉眼檢查，例如露腦；②肉眼檢查內臟及軟組織畸形，例如腭裂；③骨骼畸形檢查，例如顱頂骨缺損，分叉肋等?；螜z查只限活產胎仔。以上檢查只能檢出構造與形態異常的畸形，不能檢出可能發生的生化功效或神經行為缺點。因此有人主張將實驗雌鼠保存1/4左右，待其自然分娩，并將出生幼仔喂養觀察，最少到斷奶，方便檢查可能存在的先天缺點和生理功效異常。二、流行病學研究和人類的證據在致畸實驗成果評定時，重要計算畸胎總數和畸形總數。計算畸胎總數時，每一活產幼仔出現一種或一種以上畸形均作為一種畸胎。計算畸形總數時，在同一幼仔每出現一種畸形，即作為一種畸形；如出現二種或二個畸形，則作為二個畸形計，并依這類推。計算時還要對劑量效應（反映）關系加以分析。更重要的是按下列指標將各劑量組與對照構成果進行比較。活產幼仔平均畸形出現數：即根據出現的畸形總數，計算每個活產幼仔出現的畸形平均數。對較為重要的畸形，還可分別單獨進行計數。畸形出現率：即作為畸胎的幼仔在活產幼仔總數中所占的百分率。母體畸胎出現率：即出現畸形胎仔的母體在妊娠母體總數中所占的百分率。計算出現畸形母體數時，同一母體無論出現多少畸形胎仔或多少種畸形，一律按一種出現畸胎的母體計算。在評定實驗成果和進行實驗組與對照組對比時，應當按每個母體為單位，即按每窩計算。在致畸實驗中，每個母體或每窩是實驗單位。根據上述指標，進行初步計算后，擬定受試物與否含有致畸作用的最后結論時，尚需注意下列幾點：（１）任何成果必須通過統計計算辦法進行劑量組與對照組對比；必須含有統計學意義才干認為是陽性成果。另外，還應充足注意到劑量－效應關系與否較為明顯，較為明確者才可擬定其致畸作用。（2）應當掌握所用實驗動物品系的自然畸形發生率。如出現長久以來在該品系實驗動物未曾出現過的畸形，則應特別認真看待。但即是實驗動物出現的重要畸形類型在該品系實驗動物中過去也常出現，也不能認為此項成果不含有陽性成果的意義，容易作出不含有致畸作用的結論。（3）致畸作用中動物物種和品系差別較為顯著，因此規定在兩種動物進行實驗。如果在一種動物觀察到致畸作用，二另一種未觀察到，從毒理學安全角度，能夠認為該受試物仍含有潛在致畸可能性，尚需認真看待。盡量較少人類與其接觸的機會。即使兩種動物都未觀察到致畸作用，也應對實驗辦法和實驗過程進行認真檢查，必須絕對可靠，才干作出不含有致畸作用的結論，對此應格外謹慎。（4）由于物種差別，對動物不含有致畸作用的外源化學物對人與否致畸的問題。即將動物實驗結論推論到人，尚無抱負可靠的辦法。亦應格外認真看待。凡代謝狀況及毒物動力學參數相近者，將動物實驗成果推論到人，較為可靠。另外，還可運用流行病調查辦法，進行人群調查，掌握在人群致畸作用的實際狀況。在這種狀況下，應特別注意人體的實際可能接觸的劑量。經驗表明，甚至人體需要的營養素達成一定的劑量，也呈現致畸作用，如維生素A。故考慮任何外源化學物對人體致畸作用時，必須充足考慮人體實際可能接觸量與動物實驗中的最小有作用劑量（即致畸閾劑量）之間的劑量距離范疇。致畸物以及發育毒性作用物危險度評定（1）、歐共體（EEC）和經濟合作與發展組織（OECD）建議的致畸物分級原則。重要根據動物實驗和人群調查資料，具體分級原則：1級、已擬定人類母體接觸后可引發子代先天性缺點；2A級、對動物必定致畸，但對人類致畸作用尚未擬定因果關系；2B級、動物實驗成果必定致畸，但無人類致畸資料；3級、尚無結論性必定致畸證據或資料局限性；4級、動物實驗陰性，人群中調查成果未發現致畸（2）、致畸指數：母體LD50與胎仔最小致畸作用劑量之比，即母體LD50／胎仔最小致畸作用劑量。這一比值愈大，致畸作用愈強，普通認為比值10下列者，不具致畸作用，10～100具致畸作用，100以上致畸作用強烈。（3）、相對致畸指數（RTI）：成年動物最小致死劑量（LD01）與引發5%活產胎仔出現畸形的劑量（tD05）之比值，即LD01／tD05。（4）、母體毒性與發育毒性比值：或稱成年毒性與發育毒性比值，即對母體最低損害作用劑量（A）與胎仔最低損害作用劑景（D）之比（A／D）。普通認為A／D比值為3或3以上者，則含有發育毒性危險性。比值越大，危險性越高，3下列者，相對危險性較低或不具危險性。在普通狀況下，大多數化合物A／D比值均在3下列，以及1～2范疇內。有關母體和胎仔最低損害作用的具體體現，在母體重要為體重增加減少，出現某些臨床癥狀以及死亡，對胎仔則為致畸以及其它發育毒性體現。三、發育毒性的替代實驗用動物實驗來檢測、研究化學毒物的發育毒性既費錢又費時間。數年來許多研究者始終在謀求簡樸、快速的體內、外實驗辦法，用來評價化學毒物的發育毒性和(或)探討其作用機制，迄今還沒有滿意的辦法，由于發育毒性涉及親代兩性，從配子到下一代出生的多個發育階段，不能只用一、二種辦法去回答這樣復雜的毒性問題。這些替代實驗的驗證仍然是重要的和迄今無法解決的問題，缺少公認的原則，來自實驗的敏感性的意義和對成果的特異性的評價都有疑問。已知的胚胎形成的復雜性和潛在的發育毒性機制