3,5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作葡萄糖含量（mg）0.000.40.81.22.02.83.64.0A5400.0000.0580.1620.2610.4370.6030.7370.8683,5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線+A540一線性（A540）Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作標準液蛋白質(zhì)濃度（Ag/ml）0.004.178.3316.6725.0033.3341.67A6500.0000.0980.1690.3390.4510.5920.704Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量工作曲線.A650—線性（A650）0.8000.7000.6000.8000.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.0000.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.00標準液蛋白質(zhì)濃度（Ag/ml）米氏常數(shù)1/A4.8763.9853.3702.8312.4602.0321.8311/S100.080.066.750.040.026.720.0正交實驗結(jié)果分析：啤酒酵母蔗糖酶提取、分離純化、性質(zhì)鑒定及反應(yīng)動力學實驗、實驗?zāi)康?、熟悉工作曲線的制作方法及注意事項；2、掌握3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分離提純的原理；5、掌握酶的比活力測定及其計算方法；6、掌握酶促反應(yīng)動力學中用雙倒數(shù)法測定Km的方法；7、運用正交試驗法確定溫度、pH值、離子濃度的最適條件。二、實驗原理1、蔗糖酶的提取細胞破壁：就酶在生物體內(nèi)的分布，可分為胞內(nèi)酶和胞外酶，蔗糖酶系胞內(nèi)酶。提取胞內(nèi)酶時，要破碎組織和細胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料稱為無細胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我們用的酵母菌細胞破壁方法有機械（勻漿）法、超聲波處理法、反復(fù)凍融法、化學處理法、溶胞作用（酶溶解法）、自溶法，本實驗采用自溶法。自溶法即將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當?shù)臏囟认拢毎Y(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細胞內(nèi)含物釋放出來。2、蔗糖酶的純化（1）酶的蛋白屬性兩性電離：蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。等電點(isoelectricpoint,pI)：當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。大分子(膠體)：分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1~100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。①改變離子強度；鹽析、硫酸銨分級沉淀(反抽提法)反抽提法(BackExtraction)例：E.colRNA聚合酶42%-50%硫酸銨飽和度時沉淀通常方法：先33%再50%反抽提法：再42%將包含待分離酶在內(nèi)的多種蛋白一起先沉淀出來，然后再選擇適當?shù)倪f減濃度的硫酸銨溶液來抽提沉淀物。蛋白從溶液中沉淀析出十分容易，沉淀在溶液中溶解有高特異性。改變pH或溫度；酶在未純化之前pl也是未知的，pH不宜變化過大，以免失活。Cu,Zn-SOD的純化可在70oC，10min改變介電常數(shù)；有機溶劑分級沉淀：向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。親水性有機溶劑加入溶液后降低介質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。親水性有機溶劑的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了表面水化膜的厚度，降低其親水性，導(dǎo)致脫水凝集。有機溶劑分級沉淀操作條件的控制：常用的溶劑是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜也可做沉淀劑。沉淀用有機溶劑的選擇主要應(yīng)考慮沉淀作用強、對生物分子的變性作用小、毒性小以及揮發(fā)性適中。使用有機溶劑沉淀生物大分子時應(yīng)控制在低溫下進行。一般認為蛋白質(zhì)的初始濃度為0.5-2%為好。3）根據(jù)酶分子大小、形狀不同的分離方法離子交換層析：以離子交換劑為固定相，以特定的離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進行分離的層析技術(shù)。離子交換分離的基本步驟---平衡-上樣-吸附-洗脫-再生。選擇離子交換介質(zhì)時應(yīng)注意對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)，當?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)應(yīng)選陰離子交換劑；當?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時，在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)應(yīng)首選陽離子交換劑。本實驗我們選用DEAE-52離子交換層析。3、各純化級別蔗糖酶的活力測定酶活力（enzymeactivity）：酶催化某一反應(yīng)的能力，位時間內(nèi)單位體積中底物（substrate）的減少量或產(chǎn)物（product）的增加量，也稱為比活性，一般用U/mg蛋白質(zhì)來表示，有時也可用每g或每ml酶含多少個活力單位來表示。活力（或總活力）涉及在樣品中酶的總單位，而比活力是酶純度的量度，是每毫克酶的催化活力數(shù)（U/mg蛋白）。在酶的純化過程中它的比活力逐漸升高，當酶提純時，其比活力值成為最大和恒定。本實驗中采用DNS法測定蔗糖酶活力。3,5-二硝基水楊酸比色定糖的原理：DDNS試劑-D■葡萄糖，氨基化合物（還原糖）游”（棕紅色）2）在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強度成一定比例關(guān)系（可于比色測定），所以可用DNS比色法測定還原糖的含量：蔗糖酶活力測定的原理：1）蔗糖酶催化的反應(yīng)是：蔗糖盛璽D?果糖+葡萄糖2）蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實驗條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個活力單位。3）該方法是半微量定糖法，操作簡便、快速、雜質(zhì)干擾較少。4、蔗糖酶的蛋白濃度測定①紫外吸收法：原理：大多數(shù)蛋白質(zhì)由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有收峰，可以進行蛋白質(zhì)含量的測定優(yōu)點：樣品不需要經(jīng)過預(yù)先處理，即可直接進行測定。方法簡單而快速，又不損害樣品中的蛋白質(zhì)，測定之后的樣品仍可作他用。樣品中有硫酸或其他鹽類存在也不影響測定。在柱層析分離酶或蛋白質(zhì)時，常為人們所采用。缺點：核酸在280nm也有吸收，干擾測定，但核酸的最大吸收峰在260nm。不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成也不同，因而光吸收也不盡相同，這就會帶來誤差。計算公式：蛋白質(zhì)含量(mg/ml)=1.55A280—0.76A260②Folin-酚法(Lowry法)這是測定蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法之一，由于方法簡便，靈敏度高，常為實驗室所采用，也是文獻上用得最多的方法之一。原理:(A)凡含有兩個及兩個以上肽鍵(-CO-NH-)的化合物在堿性溶液中(如Folin-甲試劑)都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物；所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物；銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸(Folin-乙試劑)還原成蘭色的鉬藍和鎢藍混合物，其顏色的深淺(在一定范圍內(nèi))與蛋白質(zhì)的含量成正比。5)、蔗糖酶酶促反應(yīng)動力學研究酶促反應(yīng)動力學(Kineticsofenzyme-catalyzedreaction)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響此速度的各種因素的科學，是酶工程研究中的一個重要內(nèi)容。其影響因素有：pH值、溫度、酶濃度、底物濃度、激活劑、抑制劑等。酶促反應(yīng)動力學方程式——米氏學說[S]：底物濃度、Km：米氏常數(shù)、Vmax:最大反應(yīng)速度、V：不同[S]時的反應(yīng)速度米氏常數(shù)(Km)的意義①Km值是酶的特征常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶的濃度無關(guān)。②Km值作為常數(shù)只是對一定的底物、一定的pH、一定的溫度條件而言，測定酶的Km值可以作為鑒別酶的一種手段。1/Km可以表示酶對底物親和力的大小,1/Km越大，表明親和力越大，多底物酶有不同的Km值，最適底物的Km值最小。實驗中采用雙倒數(shù)法計算米氏常數(shù)：將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為下列形式：以1/V對1/[S]作圖得一直線，其斜率是Km/Vmax,在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。Slope/]交試驗法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響ogonalexperj/]交試驗法測定不同條件對蔗糖酶活性的影響ogonalexperjesign)：是研究多因素多水平的一種設(shè)(6)、正交試驗設(shè)氓軌rthKm計方法，它是從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點。是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法。日本著名的統(tǒng)計學家田口玄一將正交試驗選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。正交試驗設(shè)計中，因素可以定量的，也可以是定性的，定量因素各水平間的距離可以相等也可以不等。正交試驗法優(yōu)點：(1)試驗點代表性強，試驗次數(shù)少。(2)不需做重復(fù)試驗，就可以估計試驗誤差可以分清因素的主次。可以使用數(shù)理統(tǒng)計的方法處理試驗結(jié)果正交試驗(表)法的特點：(1)均衡分散性一代表性。(2)整齊可比性一可以用數(shù)理統(tǒng)計方法對試驗結(jié)果進行處理。

因素水平A溫度因素水平A溫度（°c）BpH值C離子濃度（mol/L）1402.60.052504.60?103606.60?15本實驗因素水平表用正交實驗法只需要9次實驗三、本實驗的注意事項1、這個實驗較大，涉及到的理論知識和實驗技術(shù)都比較多用的時間也很長，要求同學們一定做好預(yù)習，把預(yù)習過程中有問題的部分記下，實驗之前和老師或同學討論。2、寫好預(yù)習報告，要求簡潔明了（并留出記錄實驗數(shù)據(jù)和實驗現(xiàn)象的位置），否則將嚴重影響實驗進