實時熒光定量PCR原理及應用謝建紅實時熒光定量PCR的基本原理

實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖.熒光擴增曲線分為三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。熒光背景信號階段：為擴增最初的10～15個循環，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。平臺期：擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。指數期：此期PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，因此我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值：是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。CT值：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數被稱為CT值。CT值與起始模板的關系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，到達熒光閾值的CT值越小，反之越大。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中縱坐標代表起始拷貝數的對數，橫坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。定量方法絕對定量：是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。相對定量：是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算表達基因的差異，也稱之為2-ΔΔCt。其他定量方法熒光定量PCR檢測模式熒光定量PCR的理論基礎：均基于熒光共振能量轉移（FRET)的原理，即當一個熒光基團與一個淬滅基團的距離鄰近時（＜10nm)，就會發生熒光能量轉移，淬滅基團會吸收熒光基團在激發光作用下的激發熒光，從而使其發不出熒光。但如果熒光基團一旦與淬滅基團分開，淬滅作用即消失。檢測模式SYBRGreenI檢測模式：SYBRGreenI是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料。與雙鏈DNA結合后，其熒光大大增強。在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBRGreenI工作原理缺點：PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，通常本底較高，引起假陽性。優點：通用性好，價格低，在科研中使用較普遍。水解探針模式（Taqman）TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚