熒光定量PCR實驗操作流程_第1頁
熒光定量PCR實驗操作流程_第2頁
熒光定量PCR實驗操作流程_第3頁
熒光定量PCR實驗操作流程_第4頁
熒光定量PCR實驗操作流程_第5頁
已閱讀5頁，還剩6頁未讀， 繼續免費閱讀

下載本文檔

版權說明：本文檔由用戶提供并上傳，收益歸屬內容提供方，若內容存在侵權，請進行舉報或認領

文檔簡介

熒光定量PCR

北京康為世紀生物科技有限公司細胞RNA提取樣品：293T細胞試劑：超純RNA提取試劑盒、氯仿、70%乙醇方法：柱式原理：細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放。釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH和鹽濃度下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離。

細胞懸液離心，倒掉上清，加入1ml

RLT；

反復吹打，使樣本充分裂解；室溫放置5min，使核酸蛋白復合物完全分離1.裂解：2.抽提：加入200ul氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置2min；4℃12,000rpm離心10分鐘，此時樣品分為三層；

上層無色水相，

中間白色蛋白質相，

下層紅色有機相，

RNA在上層水相中細胞RNA提取3.過柱子：

吸取上層水相，至新的RNase-Free管中（注：不要吸到中層）加入等體積70%的乙醇，顛倒混勻；將溶液全部加入到已裝入收集管（CollectionTube2ml)的吸附柱（SpinColumnRM）中。若一次(700ul)不能加完溶液，可分多次入；12,000rpm離心20s，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中；4.

洗滌：

向吸附柱加入700μl

Buffer

RW1，12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，

將吸附柱重新放回收集管中；

向吸附柱中加入500μlBufferRW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），

12,000rpm離心20s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；重復步驟8；12,000rpm離心2min，棄廢液，吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干；細胞RNA提取5.

洗滌：

將吸附柱置于一個新的無RNase離心管（CollectionTube1.5ml）中向吸附柱的

中間部位加入30-50μlRNase-FreeWater，室溫放置1min，12,000rpm離心1min，

收集RNA溶液，進行后續試驗或-70℃保存RNA，防止降解。注意：1）RNase-FreeWate體積不應小于30μl，體積過小影響回收率。

2）若提高RNA的產量，可用30-50μl新的RNase-FreeWater重復步驟5。

3）若提高RNA濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復步驟5。6.RNA檢測：用ddH2O，對儀器進行調零；取1ul的RNA溶液進行測定；測定樣品純度和濃度。純度：OD260/OD280=1.9-2.1<1.8蛋白質或

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明，都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等，如果需要附件，請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙，網頁內容里面會有圖紙預覽，若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間，僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理，對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯，并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容，請與我們聯系，我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論