微生物檢測技術在基層突發公共衛生事件中的綜合應用及分析成都市CDC黃薇2014年11月水和食品等的微生物污染是突發公共衛生事件中最大的危害及主要的致病因素60-70%由病原微生物引發，患病的人數約為化學引起疾病人數的兩倍波及面大，發生頻率高，常常造成較大的損失和危害而成為一個日益受到關注的公共衛生問題。需要解決的問題生物or化學？可疑食物？樣品采集？檢測項目？檢驗方法？結果解釋？突發事件之一流行病學調查家庭餐，4人共同進餐：米飯、回鍋肉、皮蛋、炒素菜、白菜豆腐湯臨床癥狀：第二天發病，均為嘔吐、腹瀉、水樣便3～10次/天臨床診斷為急性胃腸炎和急性細菌性痢疾2人未服藥，2人已進行輸液治療抽絲剝繭可疑食物比較明確生物or化學很明確

初步判斷樣品采集可疑食物：皮蛋2份（1份采自干雜鋪的同一批皮蛋、1份為病人尚未食用的皮蛋

）病人樣品：肛拭4份、嘔吐物1份比較簡單，易判斷檢測項目志賀菌沙門菌鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌檢驗方法常規檢測PCR檢測產物測序PFGE常規檢測直劃平板增菌培養—時間接種平板挑選可疑菌落TSI—幾個？生化試驗血清學試驗PCR常規PCR：沙門菌的靶基因為InvA，產物長度為316bp，引物序列為：A1:5′-AACAGTGCTCGTTTACGACC-3′，A2:5′-CCAGGCTATCGCCAATAAC-3′熒光PCR：試劑盒PCR產物測序：委托上海之江生物科技有限公司測定PFGE：中國CDC腹瀉病室提供編號樣品名稱HEMacTSI血清學試驗生化試驗(API20E)結論1病人肛拭光滑、濕潤、微凸、1mm、中心黑色光滑、濕潤、微凸、1mm、無色半透明-/+/⊕A-F++++，O4++++O5++++H多1++++，Hi++++，H2++++,H5-4705552檢出鼠傷寒沙門菌2病人肛拭光滑、濕潤、微凸、1mm、中心黑色光滑、濕潤、微凸、1mm、無色半透明-/+/⊕A-F++++，O4++++O5++++，H多價1++++，Hi++++，H2++++,H5-4704752檢出鼠傷寒沙門菌3病人肛拭無可疑菌落無可疑菌落————4病人肛拭無可疑菌落無可疑菌落————5嘔吐物未生長未生長————6市售皮蛋光滑、濕潤、微凸、1mm、中心黑色光滑、濕潤、微凸、1mm、無色半透明-/+/⊕A-F++++，O4++++O5++++，H多價1++++，Hi++++，H2++++,H5-4704751檢出鼠傷寒沙門菌7病家皮蛋未生長未生長————常規PCR擴增結果M：marker；1～4：病人肛拭；5：病人嘔吐物；6：市售皮蛋；7：皮蛋；8：德爾卑沙門菌（CMCC50719）；9：陰性對照熒光PCR-沙門菌擴增曲線1：德爾卑沙門菌（CMCC50719）；2～5：病人肛拭；6：嘔吐物；7：市售皮蛋；8：病家皮蛋熒光PCR-志賀菌擴增曲線1：福氏志賀菌（CMCC51571）；2：陰性對照；其余為病人肛拭4份、嘔吐物1份、皮蛋2份測序結果擴增長度為300bp左右的產物測序結果經與Gen-Bank數據庫中的序列比對，其序列和沙門菌的同源性為99%擴增長度為1000bp左右的產物測序結果經與Gen-Bank數據庫中的序列比對，其序列和大腸埃希菌的同源性為99%SpeI酶PFGE圖譜M：Mark；1～2

：病人肛拭分離株；3：市售皮蛋分離株

XbaI酶切PFGE圖譜M：Mark；1～2

：病人肛拭分離株；3：市售皮蛋分離株

用SpeI及XbaI酶切后的PFGE分型，兩個病人肛拭及市售皮蛋中分離出的菌株帶型完全相同3株不同來源的菌具高度同源性結果應用和分析3種方法在相同的兩個病人肛拭中均檢出沙門菌，培養法在市售皮蛋中亦檢出沙門菌，但常規PCR及熒光PCR均未檢出常規PCR及熒光PCR均在10h增菌培養（2h前增菌+8h選擇性增菌）后進行，再經6h后得到常規PCR結果，4h后得到熒光PCR結果，培養法在增菌18h后進行分離培養，5天后得到結果檢出限：常規PCR為105Copies/ml，熒光PCR為103Copies/ml應用常規PCR及熒光PCR檢測病原菌時，病人糞便、肛拭等病源性檢樣的增菌時間在10h甚至可能可以更短，但食品、水等非病源樣品的增菌時間應適當延長來源不同的3株菌生化反應不一致PCR產物測序及PFGE分型結果則表明污染了皮蛋的鼠傷寒沙門菌來源相同很好地進行了溯源PCR檢測假陽性：核酸污染假陰性：菌量低或酶抑制物的存在實驗室建設的規范實驗室質量管理體系的建立自動化儀器（熒光PCR儀等）的出現方法的標準化成為可能美國農業部食品安全檢疫署等國際官方檢測機構已將PCR方法作為快速檢測方法編寫成實驗室標準操作程序我國出入境檢驗檢疫局也制定了用實時PCR法檢測食品中致病菌的行業標準突發事件之二事件2010年9月成都市某鄉鎮中心衛生院及縣第二人民醫院發熱患者個別患者有輕微腹瀉均為當地9所學校在校學生

癥狀符合？第一次調查和處理根據初期癥狀和流行病學調查，實驗室進行了呼吸道病毒的核酸檢測，均為陰性診斷為不明原因發熱采取針對呼吸道傳播疾病的控制措施后，疫情未得到有效控制，3天中發病范圍繼續擴大，發病人數快速增長怎么辦？第二次調查和處理進一步流行病學調查后，排除食物污染途徑，懷疑可能與供水污染有關采集樣品：鄉鎮水廠、學校的自備水以及患者咽拭和肛拭確定項目：進行腸道病毒和細菌的檢測檢測項目和方法常規法指標菌：總大腸菌群、大腸埃希氏菌—水樣細菌致病菌培養：水樣和病人肛拭PCR法腸道病毒：諾瓦克病毒細菌：產毒素大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、副溶血弧菌）樣品名稱采集地點總大腸菌群大腸埃希氏菌腸道致病菌進廠水鎮水廠12.41未檢出出廠水鎮水廠未檢出未檢出未檢出自備水一小(32)200.52未檢出管網水一小未檢出未檢出未檢出管網水二小未檢出未檢出未檢出自備水三小未檢出未檢出未檢出管網水四小教學樓過道(71)200.5200.5未檢出管網水五小學生宿舍(33)38.412.4未檢出