質粒DNA的提取和瓊脂

糖凝膠電泳CompanyDocumentnumber:WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998化工專業實驗實驗名稱 質粒DNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳班級化21姓名張騰學號—成績實驗時間—同組成員王乙汀、陳秉倫、梁有向實驗目的（1）掌握堿裂解法提取質粒的原理和方法（2）掌握瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定DNA的原理和方法。實驗原理質粒質粒（plasmid）是在細菌中以獨立于染色體之外的方式存在，是細菌染色體外的小型雙鏈環狀DNA復制子。理論上講，所有的細菌株系都含有質粒，有些質粒攜帶有幫助其自身從一個細胞轉入另一個細胞的信息，即F質粒，有些則表達對一種抗生素的抗性，即R質粒，還有一些攜帶的是參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因即降解質粒。質粒的大小不定，小的不到1kb,大的超過500kb,每個質粒都有一段DNA復制起始點的序列，它幫助質粒DNA在宿主細胞中復制。對細菌的某些代謝活動和耐藥性表型具有一定的作用。目前，已發現有質粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數的細菌質粒都是閉合環狀DNA分子（簡稱cccDNA）。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌染色體的％~3%。根據相對分子質量的大小，大致上可以把質粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質量是40x106以上，較小一類的相對分子質量是10x106以下(少數質粒的相對分子質量介于兩者之間)。每個細胞中的質粒數主要決定于質粒本身的復制特性。按照復制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內只有1~2個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細胞內一般有20個左右質粒。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型。分子量較小的質粒屬松弛型。質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，某些質粒在大腸桿菌內的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內則屬松弛型。在基因工程中，常用人工構建的質粒作為載體。人工構建的質粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環素基因(Ter)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EeoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切點，就會使抗四環素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素，但對四環素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨芐青霉素又抗四環素，而沒有pBR322質粒的細菌將對氨芐青霉素和四環素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。質粒運載體的最大插入片段約為10kb(kb表示為千堿基對)。圖1.質粒作為載體在基因工程中的應用應用質粒作為基因克隆的載體分子，攜帶外源基因進入細菌體內進行擴增或表達，一個重要前提條件是要獲得批量純化的質粒DNA分子。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解。在質粒DNA的分離和純化過程中，毫無疑問，宿主細胞的裂解是分離質粒DNA實驗操作的關鍵步驟。常用的質粒DNA分離方法有3種：堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法。前兩種方法比較劇烈，它們可以破壞堿基配對，使宿主細胞的線性染色體DNA變性，而共價閉合環狀DNA由于拓撲纏繞，兩條鏈不會互相分離。當外界條件恢復正常時，質粒的DNA雙鏈又迅速恢復原狀，重新形成天然的超螺旋分子，其大小范圍在1KB至200kb以上不等。所以，質粒DNA提取與純化是最基本的分子生物學實驗技術，其中，堿裂解法提取的質粒產量高、純度好，是一種最為常用的方法。堿裂解法堿裂解法提取質粒的實驗原理是在pH?堿性環境中，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態。將pH調至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態。通過離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，收集上清即可得到富集的質粒DNA。近年來，隨著基因治療和DNA疫苗的發展，質粒逐漸成為一種新型的生物大分子醫藥產品，藥用質粒的大規模制備成為生物下游過程的重要研究課題。采用此堿裂解法制備高拷貝數質粒（如pUC系列）時，質粒DNA的產量通常約為3~5“g/m菌液。隨著生化技術的發展，市場上出現了商品化的試劑盒用于提取及純化質粒，有些試劑盒采用了傳統的SDS堿裂解法，結合DNA制備膜技術，具有高效、快速、方便之特點。還有些試劑盒利用層析的原理純化質粒DNA,DNA分子中磷酸二酯鏈骨架在高鹽作用下脫水，使得暴露的磷酸基團吸附硅膠，經水溶性緩沖液重新水化后，DNA能從層析柱上回收。大多數試劑盒分離純化的原理為先使經過分離的質粒DNA吸附在柱或膜上，然后常規用乙醇洗滌，最后用水將吸附在柱上或膜上的DNA用水溶解下來。實驗中采用的普通質粒提取試劑盒為Tiangen普通質粒小提試劑盒。下圖為質粒DNA制備的原理。圖質粒DNA制備原理凝膠電泳電泳技術是分離、純化DNA和鑒定DNA大小的重要方法。生物大分子如核酸、蛋白質、多糖等，在一定的pH條件下，可以解離成帶電荷的離子。在電場中這些帶電荷的離子，可以根據電荷的性質向正極或負極移動。這種帶電荷物質在電場中向其相反電極泳動的現象稱為電泳。在電泳過程中通常要考慮泳動率，泳動率又稱遷移率，是指帶電荷顆粒單位時間荷單位電場強度下，在電泳介質中泳動的距離。泳動率與樣品分子荷電密度、電場中電壓及電流成正比，與樣品的分子大小、電泳介質黏度與電阻成反比。不同大小的帶電分子具有不同的泳動率。不同的電泳介質具有對樣品不同的分辨效果。在進行核酸電泳時，注意DNA分子的構象，在分子質量相同時，以高度超螺旋的DNA泳動速度最快，隨著超螺旋程度降低，相應DNA泳動速度依次變慢，最慢者為線狀雙鏈DNA。在通常情況下，線狀DNA分子在一定濃度瓊脂糖介質中泳動的速度與其分子質量的對數成反比。因此，利用DNA分子長度（bp）的負對數與泳動距離作圖，對于DNA片斷分子質量測定方便而準確。緩沖液是電場中的導體，其種類、pH及離子強度會直接影響電泳效果。通常要選擇緩沖離子泳動速度應和樣品的泳動速度一致，否則會引起帶型不均一或不對稱峰的出現。在分離核酸時，常選用較高的pH值，使樣品帶負電荷，在電場中向正極泳動。以電泳支持介質主要可以分為聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，以電泳方式可以分成垂直型和水平型。一般來說，聚丙烯酰胺凝膠電泳用來分離較短的核酸片斷（5~500bp），分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳，而后者多用于~60kb的較大核酸片斷。垂直型電泳裝置分離效果比水平型略好，多用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。水平型電泳幾乎為所有的瓊脂糖電泳所采用，其優點是灌膠、制板及加樣等操作都較為方便且不會因機械壓力引起低濃度凝膠的破裂。圖.水平電泳裝置結構示意圖瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標準方法。該技術操作簡便、快速，分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可以分離長度為200bp至50kb的DNA。瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線型高聚物。瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化形成清澈、透明的溶液，然后將溶液倒人膠模中，令其凝固。凝固后，瓊脂糖形成一種固體基質，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在外加電場作用下，帶負電荷的DNA分子向陽極遷移，遷移速率由以下參數決定：①DNA的分子大小；②瓊脂糖濃度；③DNA的構象；④所加電壓；⑤電場方向；⑥堿基組成與溫度；⑦嵌入染料的存在；⑧電泳緩沖液的組成。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為受DNA的堿基組成或凝膠電泳溫度的影響不明顯，瓊脂糖凝膠電泳一般在室溫下進行。瓊脂糖濃度和所加電壓對遷移速率的影響比較值得注意。一個給定大小的線狀DNA片段，其遷移速率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同，采用不同濃度的凝膠有可能分辨長度范圍廣泛的DNA分子。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是，隨著電場強度的增大，高分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長。因此，隨著電壓的增大，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。圖.電泳上樣示意圖樣品經電泳后形成的條帶必須經過染色后才能被顯示出，以進行分析和檢測。觀察瓊脂糖凝膠中DNA的最簡便方法是利用熒光染料進行染色。熒光物質含有一個可以嵌入DNA堿基之間的平面基團，DNA與之結合后在紫外線照射下呈現熒光。實驗室中最常用的熒光染料是溴化乙錠（EB）。其原理是在紫外線照射時，核酸的吸收波長為254nm的紫外線并將能量傳遞給溴化乙錠，同時嵌入在核酸堿基間的溴化乙錠吸收302nm和366nm波長的紫外線，來自兩方面的能量最終激發出波長為590nm的紅橙色的可見熒光。通常用水將EB配制成1mg/mL的貯存液，于室溫下避光保存。該染料通常以yg/mL的濃度摻人到凝膠和緩沖液里，電泳后直接觀察。也可在不加EB的條件下進行凝膠電泳，電泳完成后將凝膠浸在含EByg/mL）的電泳緩沖液或水中，于室溫下染色20min左右后觀察。EB的存在將使線狀雙鏈DNA的電泳遷移率降低近15%。應該注意的是，溴化乙錠是強誘變劑，并有中度毒性，取用這種染料的溶液時務必帶上防護手套。如不慎與皮膚接觸，應立即用清水徹底沖洗，含有溴化乙錠的溶液在使用后，不得隨意丟棄。出于安全性的考慮，本實驗對凝膠的染色未采用溴化乙錠，而是選擇了更加安全低毒的GoldView?核酸染料。它是一種新型的核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測DNA時，GoldView與核酸結合后能產生很強的熒光信號，其靈敏度與EB相當，使用方法與之完全相同經過熒光染料染色后的凝膠，在暗室條件下，經過紫外燈照射激發可以出現相應的可見熒光。實驗者可通過肉眼或儀器進行觀察，紫外線投（反）射儀原理如圖。隨著科技的發展，各種自動化很高的相關儀器，設備相繼問世。這些先進儀器的使用使得測量結果更加接近真實值，凝膠掃描儀和圖像分析系統就是具有代表性的儀器。凝膠掃描儀主要用來對樣品單向電泳后的區帶進行掃描，從而得出定量的結果。凝膠掃描儀的出現大大縮短了電泳結果的分析時間，更主要的是提高了電泳結果分析的準確性。掃描儀所得的圖譜通過計算機進一步進行數據加工處理，提高了數據的分辨率、準確度和靈敏度，特別是在背景扣除、積分方法等數據處理上可以根據情況來選定，從而使得測量結果與真實情況更加接近。而圖像分析系統將凝膠譜圖攝制下來，進一步將信息數字化，同時輸入到計算機中再進行分析，使測定結果更加迅速、精確。現在的凝膠成像以及圖像分析系統不但可以做蛋白質定量，而且也可以做熒光和放射自顯影測量，大大地推動了分子生物學的研究進展。凝膠掃描儀的原理和結構與分光光度計基本一致。其結構分為光源、單色器（或濾光片）、樣品室、光電倍增管、結果顯示等幾部分。樣品室是為專門放置凝膠板而設計的。根據設置的不同光源，掃描儀可有不同的功能，如為紫外光源，可以掃描未經染色的凝膠。而采用可見光源的掃描儀只能對于染色凝膠進行檢測。根據掃描儀視光路的不同，有透射方式測定和反射方式測定兩種，前者能掃描可以透光的凝膠，而后者因光束方向可以改變，則可以掃描不透明的電泳轉移膜、層析板等大腸桿菌及質粒載體大腸桿菌（Escherichiacoli,）是革蘭氏陰性短桿菌，大小xl~3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。能發酵多種糖類產酸、產氣，是人和動物腸道中的正常棲居菌，嬰兒出生后即隨哺乳進入腸道，與人終身相伴，其代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長，減少蛋白質分解產物對人體的危害，還能合成維生素B和K以及有殺菌作用的大腸桿菌素。它的主要特點有以下幾點：1、大腸桿菌是細菌，屬于原核生物；具有由肽聚糖組成的細胞壁，只含有核糖體簡單的細胞器，沒有細胞核有擬核；細胞質中的質粒常用作基因工程中的運載體。2、大腸桿菌的代謝類型是異養兼性厭氧型。3、人體與大腸桿菌的關系：在不致病的情況下（正常狀況下），可認為是互利共生（一般高中階段認為是這種關系）；在致病的情況下，可認為是寄生。4、培養基中加入伊紅美藍遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在。5、大腸桿菌在生物技術中的應用：大腸桿菌作為外源基因表達的宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡單，培養條件簡單，大規模發酵經濟，倍受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛，最成功的表達體系，常做高效表達的首選體系。6、大腸桿菌在生態系統中的地位，假如它生活在大腸內，屬于消費者，假如生活在體外則屬于分解者。7、它的基因組DNA為擬核中的一個環狀分子。同時可以有多個環狀質粒DNA。TOP10菌株屬于大腸桿菌，它適用于高效的DNA克隆和質粒擴增，能保證高拷貝質粒的穩定遺傳。質粒載體pET系統可以使各種目的蛋白得以最優化表達。受噬菌體T7強轉錄及翻譯（可選擇）信號控制；表達由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導。T7RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50%以上，但非充分誘導時，能很容易地通過降低誘導物的濃度來削弱蛋白表達。在非誘導條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態而不轉錄。用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白對宿主細胞的可能毒性造成的質粒不穩定。實驗材料主要器材電子天平，冰箱，超凈工作臺，搖床，高速離心機，旋渦振蕩器，制冰機，微量移液器，微量離心管，微波爐，瓊脂糖凝膠電泳儀(DYY-6C型，北京市六一儀器廠)，紫外凝膠成像系統(DNRBio-ImagingSystems)，封口膜，一次性手套。主要試劑菌種：含有PET28a質粒的大腸桿菌ToplO，卡納霉素抗性。含有pUC18質粒的大腸桿，菌氨芐青霉素抗性。LB液體培養基：酵母浸膏5g/L,胰蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,pH卡納霉素：100mg/mLPlasmidminikit質粒小量提取試劑盒(Biomiga公司)瓊脂糖：電泳級DNAMarkerIV,由6條線狀雙鏈DNA條帶組成，分別為7000、5500、3500、2000、1000和500bpGoldViewTM亥酸染料(賽百盛)TAE溶液:40mmol/LTris-乙酸鹽，1mmol/LEDTA10x點樣緩沖液(LoadingBuffer,Takara)實驗方法菌體培養(前期準備工作)將50吐甘油中保存的菌液接入固體LB平板37°C過夜培養，挑取單菌落接入10mL液體LB培養基(其中卡納霉素的濃度為50ug/mL)，37C，200rpm過夜培養。質粒提取按照Plasmidminikit質粒小量提取試劑盒(Biomiga公司)進行操作：37C。過夜培養的菌液1~4mL13000rpm離心1min,收集菌體，并盡可能的去除上清，以防止后面菌液裂解不充分和沉淀不完全的情況；使用250卩1BufferAl充分重懸沉淀；加入250卩1BufferBl后反轉離心管使液體混合均勻，然后靜置4min,最好出現溶液粘稠且澄清的現象，否則可以考慮加大B1的量或者減少菌液的量；加入350卩1冰箱預冷的BufferN1后立即反轉多次至溶液充分混勻，出現白色絮狀沉淀后放置于冰浴上靜置2min；室溫下13000rpm離心10min,—次到多次直至上清中沒有沉淀為止，然后將上清轉入帶有已平衡好的DNA柱中，放置于收集管中室溫下13000rpm離心1min,,重復兩次后棄濾液；向DNA柱中加入500卩1BufferKB,室溫13000rpm離心1min,倒掉收集管中的濾液；向DNA柱中加入500卩1DNAWashBuffer,13000rpm室溫離心1min,重復兩次后棄濾液；開蓋后室溫13000rpm離心5min,或者置于超凈臺中風干殘留的乙醇，以保證最后的洗脫效率；將純化柱置于新的ml離心管中，加入50卩1預熱的ElutionBuffer。室溫下放置2min后13000rpm離心1min,重復兩次后，收集洗脫液。測定得到的純化產物的濃度，保存于-20C。冰箱中待用。瓊脂糖凝膠電泳A制膠a） 利用1XTAE溶液配制％瓊脂糖25ml（濃度由目的條帶大小決定），微波加熱使之溶化；b） 加入吐GoldView，輕輕搖勻，避免產生氣泡；c） 將制膠床放入水平放置的制膠托盤中,插好梳子,倒入融好的瓊脂糖凝膠；d） 待凝膠充分凝固（30min）后，拔下梳子。B加樣e） 將制膠床連同凝膠一起放入電泳槽中；f） 加入電泳緩沖液TAE,浸沒膠面1mm左右；g） 10pL的樣品和2yL點樣緩沖液在封口膜上混和，然后點在點樣孔中；將4“L的DNAMarker點在點樣孔中。C電泳蓋上透明上蓋；接通電源線，選擇工作電壓，120V,30min,打開電泳開關；當加樣緩沖液中的溴酚藍遷移至足夠分離DNA片段的距離時，關閉電源，將凝膠在紫外燈下觀察，并用凝膠成像系統成像保存電泳圖。(請注意觀察，如溴酚藍已經接近另一端時可及時停止)如需要進行切膠回收，需要盡量保證目的DNA片段暴露在紫外燈下的時間比較短。注意事項瓊脂糖溶液微波加熱時間不易過長，以免液體大量蒸發；所用器具需要高壓滅菌；堿裂解過程中混和的動作要溫和，切勿振蕩。將融好的凝膠倒入制膠床前需要冷卻至70°C以下，高溫凝膠會使制膠床變形；凝膠放入電泳槽時點樣孔靠近陰極側(通電后氣泡較多的一側)；上蓋的小凸塊應插入槽體，并壓下安全按鈕；本實驗中使用的染色劑的是GoldView，無毒。但實驗中依然應注意戴手套操作，且接觸染料的手不要隨意接觸其他器皿，養成良好的實驗習慣6實驗結果菌液OD值提取菌液在稀釋四倍后(1ml菌液，3ml水)的吸光度為：pUC：pET：。在可見光區測定提取的質粒吸光度兩份樣品得到結果分別為：結果整理如下：表1提取質粒各項指標電泳瓊脂凝膠中瓊脂糖的濃度為%電泳得到的圖片為：從左至右依次為同組實驗者的跑膠結果，較暗區域內的是我做的結果，左邊兩條可能濃度較低而顯得稍暗，但各個條帶均是清晰可見的。根據DNAMarker可以讀出四條膠帶的bp值：

表2電泳結果樣品pET（酶切）pETpUC（酶切）pUCbp值5200330023001800參考值5369/2686/從電泳結果可以看出，這次質粒提取比較成功，得到了較為理想的質粒并成功的進行了酶切，從電泳結果來看效果很好。但提取出的兩份質粒的濃度均不是很高，可能是由于實驗過程中某些操作不理想導致了一些損失。酶切后的線性片段與環狀質粒相比，明顯可以看出環狀質粒的表觀分子量更小，但實際上二者是相同的，之所以電泳結果不同，是由于環狀質粒在凝膠電泳中由于自身環化使其在凝膠中的阻力變小，在凝膠中運動的更快，所以表現出更“輕”的現象同時與同組的其他實驗者相比較，與我同組的另一實驗者（從左至右第二組）的實驗結果與我的結果非常相近，但卻與另外兩組的結果卻相差較大。分析實驗過程，結果相近的兩組均為同步進行的操作，添加的試劑與時間均完全相同，所以這可能是導致實驗差異的原因。7思考題⑴溶液I、II和m中各成分在裂解過程中的作用是什么所謂溶液I、II和III指的就是:BufferAl、BufferBl、BufferN1BufferAl中含有：葡萄糖、EDTA、Tris-Cl、RNaseA。葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機械剪切作用，防止破壞質粒DNA；EDTA的作用是絡合掉Mg2+等二價金屬離子，防止DNA酶對質粒分子的降解作用；Tris-Cl能使溶菌液維持溶菌作用的最適pH范圍；RNaseA的作用是降解RNA。BufferBl中含有：SDS、NaOH。SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性；NaOH（pH〉12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性。BufferNl：KAc、HAc。可以中和BufferBl的堿性，使DNA復性，而由于染色體DNA與質粒DNA的性質的不同，將導致兩種DNA的分離，即染色體DNA相互纏繞，而質粒DNA復性成環；K噲與SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質形成沉淀而除去。溶液中的染色體DNA也會與蛋白質-SDS形成相互纏繞的大分子物質，很容易與小分子的質粒DNA分離，此外，高鹽溶液也有利于各種沉淀的形成，但需在后續的步驟中出去鹽。（2）沉淀法濃縮核酸可以采用的有機溶劑有哪些試分析各種溶劑沉淀法的優缺點。溶劑沉淀法是指某些有機溶劑能降低溶液的電解常數，從而增加質分子上不同電荷的引力，使溶解度的降低，同時，由于有機溶