淺析食品中諾如病毒檢測技術研究【摘要】在最近幾年中，食源性疾病高發(fā)，飲食成為了人們面臨的重要課題。研究表明，在食源性疾病傳播中，病毒有著重要地位。諾如病毒(Norovirus，NoV)是一種杯狀病毒，是導致急性病毒性腸胃炎發(fā)作的重要因素，容易在一些集中的場所爆發(fā)，比如學校、醫(yī)院、餐館等。在本文中，分析了諾如病毒主要的檢測技術，同時分析了技術使用的優(yōu)點和缺點，希望給諾如病毒之后的研究帶來參考。【關鍵詞】食品；諾如病毒；檢測；技術一、核酸檢測（一）RT-qPCR在諾如病毒檢測中，分子RT-qPCR檢測是其“金標準”，有著很強的敏感性和特異性，能夠快速檢測到糞便和其環(huán)境中的諾如病毒核酸，同時能夠對病毒載量進行測定。在測序PCR產物時，能夠判斷諾如病毒基因型。過程：（1）提取病毒RNA：使用德國QIAGEN公司的QIAampVialRNAMinikit試劑盒，采用柱純化技術，操作步驟按試劑盒說明書進行，最后以30μL洗脫液洗脫。（2）熒光定量RT-PCR法檢測：實驗反應體系采用上海之江生物科技有限公司NorwalkVirusRealTimeRT-PCRkit。操作步驟按試劑盒說明書進行相對定量檢測，用MJRe-searchOption2熒光定量PCR分析儀，最后根據檢測樣品的RT-PCR反應體系擴增曲線在FAM檢測通道有無對數增長期或Ct值判定是否陽性:1無對數增長期或Ct值≥37，判為陰性;2有對數增長期且Ct值≤35，判為陽性。3有對數增長期且3535，判為陰性。該試劑盒能同時檢測GI和GⅡ型，最低度檢測限103copies/mL。RT-qPCR能夠在單一反應內放大信號，對熒光信號進行實時檢測，從而實現(xiàn)定量效果。在實際中，該檢測方式有著很強的特異性，并且靈敏性高，是當前檢測NoV的“金標準”。這種檢測方法靈敏度能達到103DNA拷貝數/mL，同時也不會和其他腸道病毒產生交叉反應，分析靈敏度高。RT-qPCR是當前使用最為普遍的檢測方式，其特異性很強、靈敏度高，然而卻難以將致病性以及非致病性諾如病毒顆粒區(qū)分開來，在食品樣品基質內，有很多分子檢測抑制劑，同樣會影響到檢測的結果。因此，很多研究將其和其他技術綜合起來分析，比如先使用PGM，分離活性病毒粒子，然后再使用RT-qPCR。（二）數字PCR微滴式數字PCR在使用中首先微滴化處理樣品，其中產生熒光信號判讀為1，否則為0，按照陽性微滴比例判斷結果。ddPCR不需要依靠外部曲線標準，突破了Ct值局限，成為了一種可以代替RT-qPCR的方式。同時，其使用有著很高的靈敏度，不會被基質抑制，能夠精準檢測，是十分理想的檢測方式。在當前，更多研究集中在數字PCR上，在食源性致病微生物檢測中有著顯著的優(yōu)勢。然而其設備十分昂貴，影響著技術的應用，相信在未來的發(fā)展中，隨著儀器成本的降低，這種檢測方法能夠得到很好的普及。（三）二代測序技術二代測序（NGS）主要是在基因芯片和PCR上產生的，是DNA測序的一種，該技術能夠對DNA復制的流程進行記錄，測序其中新添加堿基包含的特殊標記，有著高速、高通量的優(yōu)勢。一般RT-PCR只可以對NoVRNA存在進行簡單的檢測，很難分辨出是感染性或者是非感染性的病毒顆粒。為了防止非感染性病毒顆粒出現(xiàn)假陽性的問題，要實施樣品的RNase預處理。研究表明，NGS技術的應用能夠對冷凍漿果內的致病性病毒進行檢測。二代測序技術能夠鑒別分析一些罕見和常見的NoV變異序列，在分型溯源中有著顯著的優(yōu)勢。另外，該方法要進一步進行優(yōu)化，大大減少其中的干擾序列，要求能夠在高度豐富的核酸條件下更加方便檢測，比如DNases處理樣品。二、免疫學檢驗免疫學檢驗是使用特異性抗體對樣本內的NoV進行檢測。使用量化或檢測分析物的不同標記方式，又可以劃分成不同的類型，在當前，主要檢測諾如病毒的技術方法包含免疫層析技術和ELISA。（一）免疫層析技術免疫層析技術主要是基于免疫滲濾逐漸發(fā)展形成的新型免疫學檢測方式。在樣品中如果有相應抗原，就會和抗體產生特異性反應，檢測線展現(xiàn)出能夠看見的條帶。免疫層析有著很長的保質期，同時其檢測時間短、成本低等等，很多商業(yè)免疫層析試劑盒也得到了廣泛的應用。在Kumthip的研究中，對最新的諾如病毒免疫層析試劑盒進行了驗證，測試了其在諾如病毒檢測中的特異性和敏感性，同時和RT-PCR技術做出了對比。結果表明，該試劑盒的應用有著很強的特異性和靈敏度，同時和一些胃腸炎病毒不會產生交叉反應。因為免疫層析技術的特異性低、靈敏度差，因此其分型NoV的能力不足，多數應用在臨床樣本檢測中。但可將其與其他技術聯(lián)合以提高檢測的靈敏度，從而滿足食品中NoV的檢測要求。（二）ELISAELISA技術的應用能夠把抗體或抗原結合在固相載體表面，之后添加酶標抗體或抗原，在抗原抗體產生特異性結合下，酶催化底物就會顯色，這就實現(xiàn)了檢測的目標。ELISA檢測方式容易操作、檢測時間短等等。在臨床中，很多商業(yè)ELISA試劑盒都得到了廣泛的應用。比如英國的DakoCytomation公司研發(fā)了IDEIATM諾如病毒試劑盒，德國也研發(fā)了該技術，然而這些試劑盒應用中的特異性和靈敏度存在很大差距，同時可能產生假陽性的情況，影響了其推廣和使用。在食品中如果NoV的量少，然而ELISA檢測的最低濃度是104病毒顆粒/g，這就無法滿足低濃度的檢測使用。ELISA和另外一些免疫學檢測方法相同，其特異性和靈敏度低，最低的檢測濃度是104～106個病毒顆粒/g，無法滿足食品基質內的NoV檢測。在當前，一些新技術層出不窮，這給食品內NoV檢測帶來很大幫助。在最近的研究中，將近紅外熒光和免疫層析法綜合起來，設置了一種便攜式試紙條，能夠檢測貝類中的諾如病毒。當前新型的免疫分析方法主要是在納米材料基礎上，可以檢測黃瓜、雞肉和生菜內的諾如病毒。在當前，免疫學技術和其他技術的綜合使用顯著提高了檢測的效率，大大增強了檢測的靈敏度，能夠更好地符合食品中諾如病毒的檢測需要，同時檢測操作十分方便。三、生物傳感器生物傳感器的應用原理是把生物響應轉變成能夠進行測量的光、電以及物理信號，包含了理化轉換系統(tǒng)和生物刺激性材料識別元件。按照應用信號轉換器的不同，生物傳感器又可以劃分成為光學、電化學、半導體生物傳感器和壓電晶體。該設備使用的靈敏度高、成本低廉、分析快等等，有著很強的集成化和自動化，這些也都成為研究的重點。（一）電化學生物傳感器電化學生物傳感器是一種將生物識別轉換為電流、電位、阻抗等電信號的傳感平臺，具有低成本、高靈敏度的特點。在Baek研究中，使用NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽作為一種結合劑，研發(fā)出了電化學生物傳感器。NoroBP多肽可以和NoV特異性結合。該多肽包含巰基，能夠生成Au—S共價鍵把多肽包在電極上，在這種情況下，隨著病毒的增加，電流信號呈現(xiàn)出遞減趨勢。電化學生物傳感器檢測的敏感度高，同時其下限在1.7拷貝數/mL，有著很高的靈敏度，特別實在牡蠣樣品中的應用，能夠實現(xiàn)6.21拷貝數/mL的檢測。NoV衣殼蛋白檢測和諾如病毒樣顆粒都能夠實現(xiàn)間接的。Guo等研發(fā)出了一種光電化學生物傳感器，主要進行特異性檢測。在這個該傳感器中，電極光電流能夠跟隨NoV的衣殼蛋白濃度出現(xiàn)變化，能夠半小時內使用濃度依賴形式檢測到2×10-10g/mL的NoV衣殼蛋白。另外，Lee在研究中應用了外加磁力，把金/磁性納米顆粒修飾的石墨烯沉積在叉指式鉑電極上作為電傳感通道，之后和GII型NoV抗體偶聯(lián)，成為病毒顆粒傳感平臺。這個傳感平臺的使用能夠對毒樣顆粒的變化使用電阻變化形式表現(xiàn)出來，檢測限是1.16pg/mL。電化學生物傳感器有著很高的靈敏蘇，同時也是新型工具，能夠進行快速診斷，增強檢測的靈敏性，然而在實際中，并沒有進行普及和推廣。（二）光學生物傳感器光學生物傳感器包含類型眾多，同時需要使用的樣品少，具有無標記的特點，其特異性和靈敏度都很多，可以進行實時檢測，在諾如病毒檢測中有著很大的應用潛力。在實際中，局域表面等離子體共振是使用最多的傳感方式，能夠快速響應，同時其衰變長度短等等，能夠對物體表面的分析物進行高精度檢測。Heo等應用這項技術研發(fā)了人源NoV的傳感器，主要是由親和肽引導的。親和肽能夠在多價M13隨機肽庫內篩選出來，和NoV產生特異性結合，在ELISA鑒定后，其和NoV結合的親和力是納摩爾級別。NoV衣殼蛋白含量和LSPR信號中的吸光度呈現(xiàn)正比，同時其最低檢測限是0.1ng/mL。然而在實際的LSPR傳感中，必須要對反應條件進行嚴格的控制，減少非特異性結合，配體在傳感器表面固定之后，就會導致天然構型產生變化，影響到和分析物之間的結合。另外，熒光的光學傳感器也能夠應用到食品的諾如病毒檢測中。除了光學生物和電化學的傳感器，另外還有很多生物傳感器也都可以進行諾如病毒的檢測，比如比色型生物傳感器、基于質量的生物傳感器（石英晶體微天平和微懸臂梁）、免疫傳感器等。在這些檢測方法中，生物傳感器的應用優(yōu)勢最顯著，比如其成本低廉、使用的樣品量很少、有著很高的靈敏度、能夠快速進行分析等等，在檢測食品內的諾如病毒方面有著突出的優(yōu)勢。然而雖然生物傳感器的應用有著眾多的優(yōu)勢，能夠大大提高檢測靈敏度，然而在實際中并沒有推廣和普及，并且使用配體捕獲NoV時，有時會對配體天然構象造成改變，阻礙了其和分析物的結合，因此必須要在未來進行改進。四、結束語諾如病毒是導致急性胃腸炎的主要病原，因為其生物學特性突出，十分容易造成食品污染。檢測食品內的諾如病毒能夠給諾如病毒胃腸炎的防治帶來基礎和保障。在長期的研究中，食品諾如病毒檢測技術也獲得了很大的發(fā)展，人們對其基因分型、病學特征和檢測診斷等等有了更為全面的認識。然而在當前的諾如病毒檢測技術中，依然存在很多不足和挑戰(zhàn)，必須要深入研究?！緟⒖嘉墨I】[1]徐蕾蕊，李丹，汪琦，馬丹，魏詠新，魏海燕，趙曉娟，張西萌，曾靜.基于RT-ddPCR技術的食品中諾如病毒定量檢測[J].食品科學，2022，43(20):313-320.[2]廖小艷，陳麗麗，白亞龍.食品中諾如病毒檢測技術研究進展[J].食品與機械，2021，37(04):200-206+232.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2021.04.037.[3]YanzhenHan，JianchangWang，ShuhongZhang，JinfengWang，ChenQin，YanqingHan，XiangdongXu.RapiddetectionofnorovirusgenogroupIIinclinicalandenvironmentalsamplesusingrecombinasepolymeraseamplification[J].AnalyticalBiochemistry，2020，605.[4]ValentinaTerio，PatrizioLorusso，AnnaMottola，CanioBuonavoglia，GiuseppinaTan