亞低溫對驚厥性腦損傷的保護作用

痙攣是兒童常見的疾病，發病率為3%4%，其中20%是反復發作性痙攣和痙攣狀態的患者。驚厥反復發作或持續狀態可導致腦損害,組織病理上,可表現為神經元壞死、細胞凋亡、膠質細胞增生及海馬硬化。如何對驚厥性腦損傷進行神經保護是目前臨床需解決的重要問題。亞低溫(33～35℃)在新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)腦保護的研究表明,其具有神經保護的作用。主要通過降低腦代謝、減少炎癥介質和過量興奮性神經遞質的腦損傷及抗凋亡作用來實現。而驚厥的產生、維持與體溫有相關性。動物實驗中,低溫(30℃)情況下,驚厥較難發生,且維持時間短,海馬損傷較輕。但驚厥產生腦損傷后予亞低溫干預是否具有神經保護作用目前尚無報道,本實驗就此進行研究。開孔后典型各模型的建立動物清潔級健康雄性Wistar幼鼠(出生18～21日齡)60只(本校動物實驗部提供)。儀器低溫箱:外徑長41cm、寬29cm、高17cm,內徑長28cm、寬21cm、高17cm,其間放入1500g冰塊,使箱內溫度維持于6～8℃;OMEGA450AET溫度探針,探針直徑0.127mm。驚厥持續狀態(SE)模型的制作和分組幼鼠隨機分成正常對照組8只和毛果蕓香堿(pilocarpine)組52只。正常對照組給予生理鹽水50mL/kg,腹腔注射。毛果蕓香堿(上海生物醫藥公司提供)組按150～180mg/kg劑量(100mg毛果蕓香堿溶于5mL生理鹽水)腹腔注射。該組用藥后觀察有無驚厥發作,驚厥組按Racine6級評定,將驚厥發作分為0～Ⅴ級。0級:無任何發作跡象;Ⅰ級:凝視、咀嚼和須動;Ⅱ級:點頭或濕狗樣抖動、搔抓;Ⅲ級:前肢局限性陣攣;Ⅳ級:伴后肢站立的全身強制性發作;Ⅴ級:伴有站立并摔倒的全身強直-陣攣性發作。Ⅳ級和Ⅴ級發作為全身性驚厥或大發作;持續30min以上的大發作即為本組SE模型。其中28只造模成功。SE模型鼠隨機分成驚厥組和亞低溫干預組(亞低溫組)。亞低溫干預驚厥后30min將幼鼠置入低溫箱,監測其肛溫和鼓膜溫度,使之維持在33～35℃,連續3d,自由攝食。免疫組化染色麻醉、灌注、切片干預后72h,經水合氯醛麻醉,生理鹽水快速經左心沖洗2min后,即予4%多聚甲醛灌注5min,斷頭取腦,再行后固定于灌注液24h,常規石蠟包埋。從視交叉處開始作冠狀連續切片,片厚5μm,取含有背側海馬最大斷面的切片,每例幼鼠分4套分別行HE染色、TUNEL(TerminaltransferasedUTP-NickEndLabelling)、GFAP(神經膠質原纖維酸性蛋白)和caspase-3(cysteine-contai-ningaspartate-specificprotease)免疫組織化學染色。TUNEL石蠟切片經常規二甲苯脫蠟至水,采用美國Roche公司試劑盒,DAB顯色。GFAP和caspase-3免疫組織化學染色石蠟切片經常規二甲苯脫蠟至水,均采用美國LABVISION公司Envision法試劑盒,DAB顯色。一抗稀釋濃度均為1∶200。顯微鏡下計數HE染色重點觀察海馬CA1、CA3區神經元改變。從每只鼠的切片中任選一張,在海馬CA1、CA3區各選取相似部位,在同一高倍(400倍)視野下,計數兩高倍視野神經元細胞,計算壞死神經元在總細胞數中百分比。免疫組化切片在圖像分析儀同一高倍視野下行單位面積陽性染色面積百分比或陽性細胞計數。統計分析數據以表示,采用SPSS11.5統計軟件進行方差分析。結果亞低溫干預前后海馬gfap陽性細胞的變化正常鼠神經元細胞核大而圓,位于細胞中央,異染色質少,似空泡狀,呈淡藍色,中央有一清楚核仁;胞質呈淡紅色,多有突起。SE鼠腦組織切片出現明顯神經元變性、死亡。表現為核染色質碎裂、核仁消失、核溶解;胞質空化或濃縮變暗,整個神經元體積縮小,胞膜皺縮,呈三角形或不規則形,最終整個細胞可呈均勻一致的紅色。神經元周圍出現空隙。病變以海馬CA3區最明顯,CA1區、齒狀回及顳葉皮質亦可見到病變神經元。亞低溫干預組壞死神經元較驚厥持續狀態組明顯減少(表1,圖1a、b、c見封三)。正常對照組海馬區可見少量淡染的棕色細胞,胞體小、突起短而少,染色淺。SE組海馬區可見大量濃染的GFAP陽性細胞,胞體肥大、突起密集、相互交織。亞低溫組GFAP陽性細胞較SE組減少,胞體縮小,突起密度降低(表2,圖1d、e、f見封三)。SE組海馬區可見典型凋亡細胞形態改變,表現為有明顯的染色質聚集、胞質濃縮、細胞核皺縮、周圍空泡形成及單個圓形凋亡小體。而正常對照組和亞低溫干預組TUNEL陽性細胞較少(表3,圖1g、h、i封三)。SE組海馬區可見到較明顯DAB顯色陽性細胞,而正常對照組和亞低溫干預組DAB顯色陽性細胞較稀疏(表4,圖1j、k、l封三)。亞低溫干預對驚厥性腦損傷的保護作用毛果蕓香堿致痙模型是常用SE動物模型,與人類癲癎有許多相似之處。毛果蕓香堿是M1、M2膽堿受體激動劑,在嚙齒類動物中經全身注射可導致抽搐發作。其致痙作用可能是通過改變離子通透性和第二信使發揮。電生理研究發現主要作用于Ca2+電流、興奮性突觸后電位和改變K+通透性。這些改變可導致腦內神經元興奮性增高。Cruickshank等通過采用乙酰膽堿受體激動劑卡巴發現M1受體優先參與了驚厥的發生,M1受體活化導致三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯形成。驚厥持續狀態可導致海馬錐體細胞壞死、凋亡,海馬硬化苔蘚狀纖維出芽神經元過度興奮,改變GABAA受體功能。凋亡蛋白酶(caspase):是一組對底物天冬氨酸部位有特異水解作用、其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。caspase在凋亡中的主要作用是:滅活細胞凋亡的抑制物;水解細胞的蛋白結構,導致細胞解體,形成凋亡小體;在凋亡級聯反應中水解相關活性蛋白,從而使該蛋白獲得或喪失某種生物學功能。caspase-3是細胞凋亡共同通路的關鍵蛋白酶。因此本實驗將caspase-3作為檢測凋亡途徑的蛋白。本實驗發現亞低溫干預對于驚厥性腦損傷具有保護作用,減少神經元壞死,特別可減少CA3區錐體細胞壞死,緩解膠質細胞增生,抑制細胞凋亡。亞低溫干預對腦外傷、缺氧缺血性腦病的保護作用已逐步得到證實。腦保護作用機制與降低腦細胞氧代謝率、改善細胞能量、在腦外傷和缺氧缺血性腦病中,均證實亞低溫可抑制細胞外過量興奮性神經遞質谷氨酸的釋放,從而減輕腦損傷。而驚厥性腦損傷的發生與過量的興奮