運(yùn)用多環(huán)芳烴的聯(lián)合效應(yīng)預(yù)測亞致死毒性的濃度環(huán)境與分子毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北卡羅萊納州立大學(xué)摘要:多環(huán)芳烴通常以多種化合物復(fù)雜的組合對環(huán)境造成污染。模型的方法提供了一種評價(jià)這些多環(huán)芳烴混合物毒性的途徑。在本研究中，我們測試了四種多環(huán)芳烴聯(lián)合作用的假設(shè)：苯，芘，熒蒽和萘。甲殼類大型水蚤暴露在亞急性中的生長速率能夠通過一個計(jì)算濃度加和的數(shù)學(xué)算法進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測，這一計(jì)算方法根據(jù)假設(shè)是這些多環(huán)芳烴對于水蚤生長影響的模式相同。對于四種多環(huán)芳烴各自的毒性的評價(jià)證實(shí)這些化合物引起了水蚤在小于致死濃度的濃度下生長遲緩的共同作用，運(yùn)用由實(shí)驗(yàn)得出的各個化合物的毒性參數(shù)得出了四種多環(huán)芳烴混合物毒性的模型。這些混合物是根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的環(huán)境中濃度和同等毒物濃度確定的。四種物質(zhì)140多種組合對于水蚤生長速率的影響由實(shí)驗(yàn)測定并且與預(yù)測模型進(jìn)行比較。濃度加和模型包括預(yù)測這些多環(huán)芳烴混合物聯(lián)合毒性和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這一模型能夠很好的由一個根據(jù)單個物質(zhì)聯(lián)合毒性反應(yīng)得替代模型進(jìn)行代表。混合物在環(huán)境中的相對應(yīng)的濃度的預(yù)測和實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被證明了是對于水蚤的生長速率沒有影響的。結(jié)果表明了多環(huán)芳烴能夠通過多種作用機(jī)制對于水蚤引起的毒性并且論證了一個合適的用來評價(jià)這些混合物毒性的模型。關(guān)鍵詞：危害評價(jià)；風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)；響應(yīng)加和；協(xié)同反應(yīng)；混合物毒性1.引言多環(huán)芳烴通過自然和人類活動不斷地進(jìn)入環(huán)境中,自然和人類的活動包括化石燃料的不完全燃燒，森林火災(zāi)以及火山活動(Baek等人，1991；ATSDR,1995；Howsam和Jones,1998)。多環(huán)芳烴也會通過工業(yè)和水處理工廠，滲透和意外泄漏而進(jìn)入水生系統(tǒng)(ATSDR,1995)。這些化學(xué)物質(zhì)在淡水湖，溪流和湖泊中無處不在。美國環(huán)境保護(hù)部門根據(jù)清潔水導(dǎo)則將126種有毒物質(zhì)中定為“優(yōu)先有毒污染物”，其中16中是多環(huán)芳烴。然而，由于多環(huán)芳烴的組成，它們從來不是單獨(dú)的化合物，而是在環(huán)境中以混合物而存在(ATSDR,1995)。應(yīng)用預(yù)測模型評價(jià)暴露在多環(huán)芳烴混合物的影響，此預(yù)測模型的發(fā)展和確認(rèn)能夠提高對這些有毒物質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。一種已經(jīng)用于預(yù)測水體環(huán)境中已經(jīng)定義的混合物毒性的方法是濃度累加法(Niederlehner等人，1998；Altenburger,2000;Cleuvers,2003)。濃度疊加的數(shù)學(xué)表達(dá)為：￡C-=1 （1）ECxi=1 iC是指由n種化合物構(gòu)成的混合物中的第i中組分的濃度，x是指對整個混合物i的影響。ECx是指單獨(dú)暴露下能夠引起和混合物（X）相同的反應(yīng)的第i中組分的i濃度。濃度累加模型的假設(shè)是以化合物所構(gòu)成的混合物通過相同的反應(yīng)模型產(chǎn)生效應(yīng)為根據(jù)的。等毒性的方法是根據(jù)濃度累加是進(jìn)一步假設(shè)混合物中的各個化合物的“濃度---反應(yīng)”曲線兩兩平行。這一方法有效地將化合物標(biāo)準(zhǔn)化，通過運(yùn)用EC50S與參考值進(jìn)行比較。公式的數(shù)學(xué)表示為：TOC\o"1-5"\h\zn EC50\o"CurrentDocument"C=￡CX嚴(yán) （2）effiEC50i=1 iC是指相對于參照化合物r得出的混合物的有效濃度，C代表混合物中各個組eff i分的濃度，EC50i代表第i個化合物的EC50。EC50r是指參照化合物的EC50。這一方法廣泛用于評價(jià)像二惡英類之類的混合物，參照化合物是TCDD。等毒性的方法也將多環(huán)芳烴應(yīng)用于應(yīng)用于致癌研究。然而，能否應(yīng)用于多環(huán)芳烴混合物在水體中的毒性是未知的。作為替代方法預(yù)測混合物反應(yīng)是根據(jù)各個化合物聯(lián)合反應(yīng)的參數(shù)確定，數(shù)學(xué)表達(dá)為：R=1-Ft1（1-R） （3）mix ii=1R是混合物總得反應(yīng)，Ri是化合物i的反應(yīng)。這一方法是假定單獨(dú)的物質(zhì)混合mix并減去其中重疊的部分。在本方法中，假設(shè)的依據(jù)是各個組分引起通過不同機(jī)制而引起反應(yīng)。在本研究中，我們應(yīng)用水體中生長迅猛的水蚤評價(jià)了四種多環(huán)芳烴單獨(dú)和混合毒性作用。從美國最近對于淡水河流的調(diào)查中獲得了應(yīng)用價(jià)值。我們的實(shí)驗(yàn)決定于這四種化合物的混合物能否在相應(yīng)的環(huán)境濃度下影響水蚤的生長速率。我們也評估了與這些多環(huán)芳烴等毒性的混合物，由此與濃度累加模型和多環(huán)芳烴聯(lián)合毒性比較。對于所有混合物，我們假設(shè)這些多環(huán)芳烴混合物的聯(lián)合反應(yīng)能夠通過濃度加和的方法模型化。2.材料和方法2.1背景實(shí)驗(yàn)中所用的水蚤已經(jīng)在北卡羅萊納州立大學(xué)培養(yǎng)了十年，培養(yǎng)條件與之前研究中描述相同（Baldwin和Leblanc,1994）。水蚤在1L的燒杯中進(jìn)行培養(yǎng)，每只燒杯中水蚤的密度是40只，一周更換三次容器。每天喂兩次食，每次喂食量為1.4x108個綠澡細(xì)胞，羊角月牙藻和4mg干重的魚食的組織勻漿。在室內(nèi)光照：黑暗是16:9的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，光照溫度為20oc。水蚤在培養(yǎng)基中在室溫條件和恒定光照下進(jìn)行培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)用水蚤年齡不低于24h。2．2單個多環(huán)芳烴暴露四種多環(huán)芳烴都是優(yōu)先污染物，并且對于水蚤生長速率的影響單獨(dú)測定。每種多環(huán)芳烴的純度在99.0%以上。每個實(shí)驗(yàn)由50組多環(huán)芳烴的對照濃度以及10組控制濃度構(gòu)成。將多環(huán)芳烴溶于乙醇介質(zhì)中。每隔一日更換溶液。所有的處理，包括對控制組的處理乙醇含量<0.01%，并且在所給定的實(shí)驗(yàn)中乙醇含量是不變的。每個濃度有一只水蚤為下一最高濃度做準(zhǔn)備，最高濃度為90%（熒蒽，菲和萘）或95％的最高濃度（芘）。每次實(shí)驗(yàn)的最高濃度根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)，并選擇在暴露的7天中最低致死濃度。每天，要通過顯微鏡檢查燒杯中水蚤的棚外骨骼。骨骼長度用目鏡測微計(jì)從甲殼頂部測量至脊椎尾部。對于每一個水蚤，將前四只測定的骨骼長度與換殼次數(shù)繪制直線，并線性回歸。直線的斜率代表水蚤的生長速率。之前的研究對這種測量水蚤生長速率的計(jì)算方法有詳細(xì)的敘述。對照組水蚤的平均生長速率作為正常的生長速率，實(shí)驗(yàn)組水蚤的生長速率以百分比表達(dá)，由于暴露在多環(huán)芳烴中，實(shí)驗(yàn)組的生長速率減少。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用軟件繪制，得到S型濃度—反應(yīng)曲線，格式如下：p_ 100 ⑷_R— T竽IpR是指生長速率的減少，以百分比表示。C是多環(huán)芳烴的濃度。EC50和p是濃度---反應(yīng)曲線的參數(shù)，分別代表引起50%反應(yīng)的濃度和曲線的參數(shù)。這些參數(shù)在混合物模型中也使用。

2.3多環(huán)芳烴混合物的暴露混合物暴露與多環(huán)芳烴單獨(dú)暴露的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類似。每個暴露都要基于一個給定的多環(huán)芳烴濃度，這一給定的濃度被認(rèn)為是對應(yīng)的暴露的基濃度。多環(huán)芳烴相對于混合物的基濃度見表1。將混合物的稀釋并配制用于實(shí)驗(yàn)組，每個實(shí)驗(yàn)組濃度是上一個濃度最高組的90%。所有實(shí)驗(yàn)組多環(huán)芳烴濃度比率相同。同樣地，一只水蚤在每一個實(shí)驗(yàn)組中暴露。與環(huán)境相關(guān)的混合物是根據(jù)美國最近的有價(jià)值的報(bào)道所確定。根據(jù)調(diào)查結(jié)果，一種混合物由中位數(shù)相同的多環(huán)芳烴構(gòu)成，另一種則是由最大濃度的各個多環(huán)芳烴構(gòu)成。進(jìn)行進(jìn)一步的混合物實(shí)驗(yàn)是為了對于等毒性模型以及單獨(dú)的聯(lián)合反應(yīng)模型能夠進(jìn)行準(zhǔn)確評價(jià)。一組實(shí)驗(yàn)與環(huán)境基準(zhǔn)混合物的設(shè)計(jì)相同，應(yīng)用各個多環(huán)芳烴EC05濃度做為基礎(chǔ)濃度（見表1）。實(shí)驗(yàn)組濃度設(shè)定為下一個實(shí)驗(yàn)組最高濃度的95%。其它組實(shí)驗(yàn)檢測了一系列在等毒性濃度條件下由四種多環(huán)芳烴構(gòu)成的實(shí)驗(yàn)組。多環(huán)芳烴混合物的等毒性實(shí)驗(yàn)組濃度從他們的EC005—EC15。此實(shí)驗(yàn)中10只水蚤在實(shí)驗(yàn)組中單獨(dú)暴露，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間應(yīng)用T檢驗(yàn)法進(jìn)行比較。2.4混合物模型預(yù)測多種混合物的影響根據(jù)方程（2）和（4），并由此產(chǎn)生如下的公式：mix1007mix10075）1C iEC50Rmix是混合物的響應(yīng)。Ci和EC50i是濃度，EC50相對于一個給定多環(huán)芳烴,p四種多環(huán)芳烴濃度一反應(yīng)曲線的平均參數(shù)。公式（2）中的Ceff和EC50r代人公式（4）中。因?yàn)閷τ诙喹h(huán)芳烴混合物來說不需要包含一個作為參照的多環(huán)芳烴，所以將EC50r去掉。通過公式（5）等效毒性法和公式（1）的迭代累加來計(jì)算混合物的毒性的相加模型。混合物的毒性模型也根據(jù)公式（3）單獨(dú)聯(lián)合毒性反應(yīng)確定。模型預(yù)測和實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過測定系數(shù)進(jìn)行比較。3.結(jié)果3.1多環(huán)芳烴化合物單獨(dú)暴露針對每個多環(huán)芳烴物質(zhì)在非致死濃度下單獨(dú)暴露的結(jié)果是生長速率減緩（見圖1）。各個多環(huán)芳烴在暴露條件下EC50和參數(shù)p的值見表2。芘和熒在近似的濃度范圍，即~10-100ug/L，生長速率減緩。同樣地，菲減緩生長對應(yīng)濃度為~40-400ug/L，萘對于減緩生長的影響不顯著，能夠引起影響的濃度大于1000ug/L。3.2混合物通過濃度加和模型的方法，能夠得出這些多環(huán)芳烴混合物根據(jù)其在環(huán)境中的比率所構(gòu)成的混合物的影響（圖2A，實(shí)線代表毒性當(dāng)量，散點(diǎn)代表濃度加和）。通過模型表明，多環(huán)芳烴的濃度選在其環(huán)境濃度的中位數(shù)濃度，不會對水蚤的生長產(chǎn)生影響。也表明了多環(huán)芳烴濃度在接近環(huán)境中位數(shù)濃度的100倍時，對水蚤生長產(chǎn)生顯著的不利影響。模型進(jìn)一步表明了多環(huán)芳烴濃度在其環(huán)境中位數(shù)濃度的100倍到1000倍的范圍內(nèi)，水蚤的生長速率會由于混合物的等級而逐漸降低。對這些多環(huán)芳烴混合物影響水蚤生長速率的直接評價(jià)與濃度加和模型的預(yù)測結(jié)果一致（圖2A）。等毒性模型的測定系數(shù)（Q）是0.73，這表明了該模型中包括了73%水蚤暴露下所測量的生長速率減少的變化值。一般濃度加和模型產(chǎn)生的預(yù)測與應(yīng)用等毒性法測定的值相同（r2=0.77）。多環(huán)芳烴混合物的各個組分比率等同于化合物在環(huán)境中最大的比率。等毒性模型和濃度加和模型都表明了，多環(huán)芳烴濃度是環(huán)境最大濃度時不會對水蚤的生長速率產(chǎn)生不利影響。然而，在濃度達(dá)到5倍時，影響會變得顯著（見表1）。模型近一步表明了當(dāng)高于5倍濃度時，水蚤的生長速率會對著混合物濃度的升高而降低。對于多環(huán)芳烴混合物對水蚤生長速率的直接測定表明濃度加和模型對此混合物的毒性測定值偏高（見圖2B）。由濃度加和模型所測定的混合物響應(yīng)閾值是其3倍（基本濃度的15倍）。此外，等毒性的測定系數(shù)（0.46）和濃度加和的測定系數(shù)（0.53）表明了，應(yīng)用這組數(shù)據(jù)使得模型的預(yù)測力下降。應(yīng)用獨(dú)立的聯(lián)合反應(yīng)（公式3）模型對于混合物試劑重新測定是為了證明，這一方法是否適用于多環(huán)芳烴混合物。當(dāng)混合物試劑濃度比率由多環(huán)芳烴在環(huán)境中位數(shù)的濃度構(gòu)成，單獨(dú)聯(lián)合反應(yīng)模型與濃度加和模型所得結(jié)果較為接近（分別是r2=0.71和r2=0.77,見圖2A）。單獨(dú)聯(lián)合反應(yīng)模型比預(yù)測模型得出r2值高（單獨(dú)聯(lián)合反應(yīng)模型r2=0.77，等毒性模型r2=0.46,濃度加和模型r2=0.53，見圖2B）。這些混合物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明多環(huán)芳烴聯(lián)合毒性較為合適的模型是單獨(dú)聯(lián)合模型，而不是濃度加和模型。為了證明單獨(dú)聯(lián)合模型適用于多環(huán)芳烴混合物毒性，在混合物基本濃度是其各個組分的EC05的濃度下，對于多環(huán)芳烴混合物對生長速率影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定并模型化。通過濃度加和模型（包括等毒性模型和一般濃度加和模型）和單獨(dú)聯(lián)合模型將混合物稀釋5倍直接測定并模型化（見圖3A）。單獨(dú)聯(lián)合模型相對于加和模型顯然更為準(zhǔn)確（單獨(dú)聯(lián)合模型r2=0.87，等毒性模型r2=0.59,—般濃度加和模型r2=0.54。見圖3A）。最后，實(shí)驗(yàn)測定了7組濃度從各自EC005到EC15范圍內(nèi)的多環(huán)芳烴混合物的等毒性混合物，并對其毒性進(jìn)行評價(jià)（見圖3B）。同樣地，單獨(dú)聯(lián)合反應(yīng)模型測定水蚤生長速率相比與兩種加和模型來說更為準(zhǔn)確。4.討論假設(shè)對四種多環(huán)芳烴的評價(jià)模型相同，我們假設(shè)濃度加和模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測混合物暴露對于水蚤生長速率的影響。結(jié)果是，相對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果兩種加和模型對反應(yīng)值預(yù)測過高。另外一種單獨(dú)聯(lián)合反應(yīng)模型能夠更為準(zhǔn)確地預(yù)測混合物毒性。盡管3種模型的不同，但是其預(yù)測值之間并沒用顯著差異，它們都能夠針對多環(huán)芳烴混合物得到恰當(dāng)?shù)亩拘灶A(yù)測值。對于等毒性法與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的反應(yīng)預(yù)測差異的一種解釋是，這四種多環(huán)芳烴與相同反應(yīng)的模式的假設(shè)不符。多環(huán)芳烴能夠通過多種機(jī)制產(chǎn)生毒性。包括非極性麻醉，形成加合物，產(chǎn)生活性氧自由基和干擾荷爾蒙。模型可能由于不同的多環(huán)芳烴是通過不同的機(jī)制引起反應(yīng)而受到一些影響。例如，在果蠅B11的細(xì)胞中，熒是一個弱的蛻皮激素受體拮抗劑。蛻皮激素受體拮抗劑能夠干擾蛻皮頻率，這就使得生長速率減緩，這個結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)測定一致。已經(jīng)在C1.8細(xì)胞蛻皮激素受體和ECR基因構(gòu)建中證明，多環(huán)芳烴芘能夠修改蛻皮激素的活性，以激活蛻皮激素受體。作者總結(jié)這些影響是獨(dú)立的。基于這些觀察，芘會通過一個不同于熒的機(jī)制干擾蛻皮激素信號并影響果蠅生長速率。我們注意到，菲和芘都會造成水蚤蛻皮頻率下降；而萘和螢蒽不會。因此，菲和芘會通過蛻皮的途徑影響生長速率，這不同于萘和螢蒽。多環(huán)芳烴對生長速率的影響能夠解釋單獨(dú)聯(lián)合模型的準(zhǔn)確性。一種毒性單元的方法已經(jīng)成功應(yīng)用于預(yù)測沉積物中多種水生生物體多環(huán)芳烴混合物的準(zhǔn)確毒性。濃度加和模型通過毒性單元法預(yù)測多環(huán)芳烴混合物對于三種無脊椎動物的影響，得到的結(jié)論是多環(huán)芳烴混合物之間的作用是協(xié)同的。Swartz等人（1995）指出對于端足目動物，測定的混合物毒性和應(yīng)用毒性單元法并由毒性模型得到的結(jié)果無顯著性差異。然而，同一模型又存在輕微的不太顯著的差異，即對于激活下的多環(huán)芳烴的預(yù)測值過高。所有的預(yù)測都與我們的測定結(jié)果一致，濃度加和的偏差不大，并且能夠?qū)τ诙喹h(huán)芳烴對于生物體