第二節基因工程的基本操作步驟第1頁，課件共23頁，創作于2023年2月獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導入受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞目的基因的表達基因工程基本操作步驟第2頁，課件共23頁，創作于2023年2月一、獲得目的基因1、目的基因較小且序列已知——用化學方法直接人工合成。2、目的基因的全部或部分序列已知——用聚合酶鏈式反應（簡稱PCR）技術擴增3、目的基因的序列是未知的——從基因文庫中獲取目的基因第3頁，課件共23頁，創作于2023年2月②用某種限制酶切成多個片段①提取某種生物的DNA第一步：建立基因文庫（一般已做好）③將片段與載體連接起來④導入受體菌（常用大腸桿菌）群體中基因文庫第二步：從基因文庫中獲取目的基因⑤根據目的基因的產物等特性，用原限制酶將目的基因切下。第4頁，課件共23頁，創作于2023年2月①用與切下目的基因的同種限制酶切開載體DNA二、形成重組DNA分子②用DNA連接酶連接目的基因和載體DNA，形成重組DNA分子。（重組質粒或重組病毒）第5頁，課件共23頁，創作于2023年2月三、將重組DNA分子導入受體細胞第6頁，課件共23頁，創作于2023年2月構建重組質粒第7頁，課件共23頁，創作于2023年2月四、篩選含有目的基因的受體細胞在含有四環素的選擇培養基上培養目的基因抗四環素基因導入只有含重組DNA分子的細胞能生長抗四環素基因抗氨芐青霉素基因與目的基因兩側相同的酶切位點含目的基因第8頁，課件共23頁，創作于2023年2月含四環素的培養基含氨芐青霉素的培養基含目的基因第9頁，課件共23頁，創作于2023年2月五、目的基因的表達

受體細胞是原核細胞時，目的基因可留在質粒上；受體細胞是真核細胞時，目的基因必須插入染色體DNA。第10頁，課件共23頁，創作于2023年2月①檢測目的基因是否插入了受體細胞染色體DNA中——DNA分子雜交技術將DNA固定在膜上，加熱解旋將帶有放射性同位素標記的含目的基因的DNA片段（探針，一般為單鏈）加到膜上提取受體細胞基因組DNA一段時間后沖洗檢測膜上是否有雜交帶（放射性）第11頁，課件共23頁，創作于2023年2月第12頁，課件共23頁，創作于2023年2月②檢測目的基因是否轉錄——分子雜交技術固定在膜上的變成mRNA，探針與①相同③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質——抗原-抗體雜交④檢測生物個體是否出現相應性狀第13頁，課件共23頁，創作于2023年2月活動：完成“基因工程操作程序的模擬操作”思考：基因工程的理論基礎是什么？第14頁，課件共23頁，創作于2023年2月原核生物界原生生物界植物界動物界真菌界第15頁，課件共23頁，創作于2023年2月DNA的結構和功能第16頁，課件共23頁，創作于2023年2月轉錄翻譯遺傳信息的表達機制相同第17頁，課件共23頁，創作于2023年2月整個生物界共用一套密碼子第18頁，課件共23頁，創作于2023年2月二、基因工程的理論基礎DNA的結構相同（雙螺旋結構）DNA功能相同（即復制方式和表達機制相同）整個生物界共用一套密碼子哪些技術能保證基因工程能夠實施？第19頁，課件共23頁，創作于2023年2月獲得目的基因形成重組DNA分子將重組DNA分子導入受體細胞篩選含有目的基因的受體細胞目的基因的表達工具?限制酶DNA連接酶載體:質粒、病毒第20頁，課件共23頁，創作于2023年2月（3）蛋白組分析蛋白質合成后，還要進行磷酸化、糖基化、除去末端氨基酸、蛋白質剪切等翻譯后修飾，僅從核酸的序列并不能完全描述一個蛋白質。盡管分析不同細胞類型中表達的蛋白已近20年，直到1995年才由Wilkins和Williams提出一個與基因組相對應的名詞蛋白組分析的核心技術是蛋白質雙向電泳。

技術上三大發明：（1）基因轉移載體的發現——1967，T.F.Roth&D.R.Helinski，發現質粒的自我復制能力，并能夠在細菌之間轉移。基因是可以轉移的。（2）工具酶的發明——1972H.C.Smith、W.Arber&D.Nathans從流感嗜血桿菌中分離得到限制性內切酶；1970年，逆轉錄酶的發現使真核細胞的基因制備成為可能；此后，多種限制酶和連接酶發現。基因是可切割的。（3）DNA體外重組的實現——1972年，美Berg第一次構建出了體外重組DNA分子。重組DNA表達實驗的成功——1973，H.Boyer&S.Cohen選用僅含單一EcoRI酶切位點的載體質粒pSC101，使之與非洲爪蟾核糖體蛋白基因的DNA片段重組。重組的DNA轉入大腸桿菌DNA中，轉錄出相應的mRNA。基因工程誕生元年第21頁，課件共23頁，創作于2023年2月技術進一步推動基因工程的發展：（1）第一例轉基因動物和轉基因植物問世——1980科學家通過顯微注射培育出世界第一個轉基因小鼠。1983，科學家采用農桿菌轉化法，培育出世界上第一例轉基因煙草。（2）PCR技術的發明——1988年，美K.Mullis發明PCR技術，使基因工程進一步發展。TheNobelPrizeinChemistry1993"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"KaryB.Mullis

LaJolla,CA,USA第22頁，課件共23頁，創作于2023年2月為了將上圖的目的基因與左圖的質粒結合，應該用_______限制酶切開質粒，這是為了保證目的基因兩端與質粒露出的________能夠堿基互補配對，之后在________作用下才能夠牢固結合，形成一個__________。將重組質粒導入受體細胞后，受體細胞將獲得___________能力。EcoR.1切點Hand.3切點Taq.1切點