玉米脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測與分析

根據《中華人民共和國國家標準》第27條第（2005年《糧食價格》中的理化指標，增加了脫氧雪腐剪刀、紅霉素和褐蛇草素的劑量。其中:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量為1000μg/kg。1脫氧雪腐施工脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)又名嘔吐毒素,主要由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)黃色鐮刀菌(F.culmorum)產生,是一種有很強細胞毒性、胚胎毒性、一定致畸性、弱致癌性,并且影響免疫系統的真菌毒素。嚴重污染該毒素的糧谷類食品和飼料,人畜食用后將嚴重危害健康。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中毒是人或動物采食被這種毒素污染的糧食等原料而引起的,以食欲廢絕、嘔吐為特征的中毒性疾病。各種動物均可發生,其中人、豬、犬、貓敏感,家禽、牛和羊有一定的耐受性。1.1慢性充果,反復咀嚼,腹瀉人中毒后食欲減退,呼吸困難,嘔吐,腹瀉。豬中毒表現食欲廢絕,嘔吐,腹瀉,血便,皮膚、黏膜紅腫和壞死,體溫下降。慢性中毒表現為食欲減退,增重減慢,呈“僵豬”。肉雞中毒表現呼吸困難,精神沉郁,離群呆立,平衡失調,反復吞咽,腹瀉。鴨中毒出現食欲減退,體重下降,雛鴨有嘔吐癥狀。1.2糧食和飼料加強該項目的檢測、防止原料和飼料發霉是預防中毒的關鍵。原料要曬干儲藏,并保持環境干燥。已經被霉菌毒素污染的飼料應脫毒后再飼喂動物。通過研磨去殼、機械加工去皮均可以從原料中減掉大部分脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素。2脫氧雪腐鐮菌烯醇法檢測ca-rendth中華人民共和國國家標準GB/T5009.111-2003中規定了谷物及其制品(蛋糕、餅干、面包等)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON、嘔吐毒素)的測定方法,即:薄層色譜測定法及免疫測定方法(ELISA)。第一法的最低檢出限為0.1mg/kg;第二法的最低檢出限為0.1ng/kg。2.1標準gb和t5009.11-2003的范圍本標準適用于谷物(小米、玉米、大麥)及其制品(蛋糕、餅干、面包等)中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON、嘔吐毒素)的測定。2.2第一法：薄膜層析成像法2.2.1增強物薄板板谷物及其制品中的脫氧鐮刀菌烯醇經提取、凈化、濃縮和硅膠G薄層展開后,加熱薄層板。由于在制備薄層板時加入了三氯化鋁,使脫氧鐮刀菌烯醇在365nm紫外光燈下顯藍色熒光,與標準比較。2.2.2膜色譜法的主要優點薄層色譜測定法是標準法,準確。缺點:操作步驟多,操作起來比較繁鎖。2.3第二檢驗方法elisa對流行病的看法2.3.1抗體混合物的制備將已知抗原吸附在固相載體表面,洗除吸附抗原,加入一定量抗體與待檢試樣(含有抗原)提取液的混合液,競爭溫育后,在固相載體表面形成抗原抗體復合物結合。洗除多余抗體成分,然后加入酶標記的抗免疫球蛋白的第二抗體結合物,與吸附在固體表面的抗原抗體復合物結合,加入酶底物。在酶的催化作用下,底物發生降解反應,產生有色產物,通過酶底物的降解量,根據標準曲線計算被測試樣中的抗原量。2.3.2免疫標準偏差法elisa的主要優點比第一法簡單,相對比較容易操作。但還是比較繁鎖,尤其是需要在4℃條件下放置過夜,用時太長,需要酶標檢測儀。2.4標準生物技術要點ELISA試劑盒檢測法與免疫測定方法(ELISA)原理一致,但操作更方便更快捷。該方法由國家糧食局標準質量中心、南京財經大學、河南工業大學、南昌博恒生物制品有限公司、江蘇省蘇微微生物研究有限公司共同編制的《糧油主要衛生指標測定技術要點》介紹。由于它方便快捷,我們通常采用此種方法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。2.4.1原理簡介本試劑盒采用間接競爭酶聯免疫吸附分析(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)原理,快速檢測大麥、玉米、大米、啤酒、麥芽汁中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)。其主要原理為:在預先包被有DON全抗原的酶標板中,加入待檢測樣品及抗DON單克隆抗體,使待檢測樣品中的DON與酶標板中的DON全抗原競爭結合抗DON單克隆抗體,溫育后洗板,再加入酶標記二抗,使其與抗DON單克隆抗體結合,最后加入酶標記二抗的底物(顯色液)進行顯色,終止顯色后通過酶標儀讀取吸光值。由于樣品中DON的含量與吸光值的大小成一定比例關系,可根據吸光值的大小來判斷樣品中DON的含量高低。進行定量檢測時,需要同時加入已知濃度的DON標準品進行間接競爭ELISA,讀取吸光值后,通過繪制標準曲線,可得到待測樣品的DON含量數值。2.4.2需要注意的事情2.4.2.檢測儀器和試劑儀器:酶標儀(具450nm濾光片)、小型粉碎機、天平、恒溫箱。移液器:20μL～200μL量程移液器、200μL～1000μL量程移液器。玻璃儀器:玻璃量筒、玻璃漏斗、三角燒瓶。試劑:蒸餾水。其它:10mL試管、200μL吸頭、1000μL吸頭、定性中速濾紙、500mL洗瓶。ELISA軟件:RIDAWINELISA軟件。2.4.2.測量過小的影響為使儀器保持最佳狀態應建立維護和校正儀器的標準程序,所需要控制的儀器包括:移液器、恒溫箱(水浴箱)、洗板機和酶標儀。ELISA操作中加樣量小(50μL～100μL),其準確性直接影響到實驗結果,可用稱量法進行檢查:吸取刻度指示的水,萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確,需控制在±10%誤差以內。放置溫度計于箱內,檢查箱內顯示溫度與實際溫度之間是否一致,控制±1℃誤差以內。洗板后殘留液不超過2μL,拍板后以紙不濕為宜。定期維護光學組分,防止濾光片霉變,定期檢測校正。2.4.2.溫度平衡的測定ELISA操作時,環境溫度要求為20℃～25℃。試劑盒從冰箱中取出時,盒中所有試劑均需放置于室溫(20℃～25℃)10min～15min,進行溫度平衡。操作完畢后,請立即將試劑瓶及未用完板條密閉,放置于4℃冰箱保存以備下次使用。2.4.2.elisa洗板和恒溫箱ELISA實驗結果受操作影響很大,ELISA中的每個步驟:加樣、洗板、溫育、顯色和讀數須嚴格操作,才可體現ELISA高靈敏度,特異性強等特點。加樣應使用適用量程的移液器,按要求的量在微孔板1/3處加入試劑,避免溢出及碰觸孔底,防止產生氣泡,每次加樣需更換吸頭,避免交叉污染。洗板步驟對于ELISA的重復性和精密度至關重要。手工洗板方法:將洗滌液注滿孔浸泡1min,隨后甩去,在干凈的吸水紙上拍干,重復此操作四次。若用洗瓶洗板需將瓶內空氣擠出,等液體流速均勻時再注入到孔中,避免孔內產生氣泡。ELISA過程中,需保證溫度的均一性,避免由于溫度的不均勻而造成邊緣效應,影響數據的準確性。恒溫箱溫育時,需放入濕盒內(在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布)進行溫育,板條不可疊加。HRP酶被TMB底物催化后呈現藍色。加入底物顯色后需避光放置于37℃恒溫箱內,顯色時間為5min,若顏色較淡可適度延長時間。顯色終止后,輕振蕩板條,使孔內液體混合均勻后,應立即置于酶標儀內450nm波長讀數,放置時間過長,會使數據不準確。使用RIDAWINELISA等專用軟件,選取雙對數模式繪制標準曲線。3玉米中ndv的檢測分別采用脫氧雪腐鐮刀菌烯醇ELISA試劑盒檢測法和國家標準第二法免疫測定法,對撫順地區2008年產玉米部分樣品中DON含量進行檢測。3.1樣品和數據來源1、2、3、4號樣品來自新賓縣南雜木糧庫;5、6號樣品來自撫順市中心糧庫;7、8、9、10號樣品來自撫順市五洲糧食有限公司。各樣品均為2008年產玉米。3.2檢測方法脫氧雪腐鐮刀菌烯醇ELISA試劑盒檢測法和國標第二法免疫測定法(ELISA)。3.3測試結果檢測結果見表1。4通過使用基于防小蝦防帶撫順地區玉米中DON的含量不高,指標多在標準限定范圍內。通過實際檢測,說明試劑盒檢測方法結果準確、可靠,是實際工作中切實可行的一種檢測方法。我地區谷物及其制品中DON含量值不高,比較理想,可能與我地區典型東北內陸氣候四季明顯,冬春季氣溫低氣候干燥較易存儲和農民及糧食收儲企業保管得當有關,從而防止了食用受DON污染的谷物及其制品中毒的危險,保證了食