基于主成分分析的赤潮藻三維熒光光譜識別測定

赤潮已成為中國和世界的一場重大海上災難，引起了各國政府和科學家的高度重視。通過正確、實時的熱重計算，準確、實時地評估和測定赤潮漂浮藻類，對于研究和控制赤潮災害具有重要意義。采用圖象知識技術、色素分析技術和熒光技術進行了區分。由于該技術具有高靈敏度、實時監測和很容易識別生物多樣性的優點，因此受到了廣泛的關注。根據藍藻中藻類的特征，lee提出了一種通用的熒光分析技術，并根據現場監測藍藻含量。kolbobski等人使用了熒光矩陣，并通過初始光譜率（f0）確定了三個主要浮游生物的數量。根據body等人的流式細胞儀，根據浮游生物的熒光性質和散射光性質的差異，利用神經網絡技術確定了72種浮游生物的識別和測定。目前，物質光譜識別技術主要是通過化學計量法提取光譜特征來實現的，主成分分析是一個常見的技術之一[11.14]。由于發生赤潮時,基本上都是1種藻占絕對優勢,這樣發生赤潮時對浮游植物群落組成的測定就轉化為對引發赤潮的藻的識別測定.本研究基于赤潮藻三維熒光光譜,使用主成分分析和非負最小二乘法對11種我國近海常見的赤潮藻種進行分析,旨在建立赤潮藻在屬水平上的實時、快速的熒光識別測定技術.1材料和方法1.1分析條件選取日本日立公司F4500熒光分光光度計及其配套的工作站軟件,1cm石英比色池.儀器分析條件:激發和發射狹縫為5nm,掃描速度為12000nmmin;激發波長的掃描范圍為400~600nm,掃描間隔為5nm;發射波長的掃描范圍為500~800nm,掃描間隔為5nm;每個樣平行測定3次,取平均值作為該樣品的熒光光譜.1.2熒光光譜的制備選用的11種東海常見赤潮藻(表1)均來自中國海洋大學海洋污染生態化學實驗室,藻種的培養實驗均在室內進行,培養容器經1∶5的HCl浸泡處理后,再用蒸餾水和二次蒸餾水沖洗,洗凈后蒸汽滅菌(121℃,0.56kg·cm-2,30min)并烘干后待用.海水經孔徑為0.45μm的濾膜過濾后,高壓鍋煮沸滅菌,靜置平衡24h,按f2配方配制營養液,作為培養介質(硅藻門以外的藻種均采用不加硅的f2營養鹽配方).實驗藻種于光照強度分別為10000lx和15000lx(400~700nm)的光照條件下培養,明暗周期12h∶12h,溫度為(20±1)℃.培養期15d,每3d取1次藻液進行分析測定,各光照條件下每個藻種平行培養3份,其中每個光照取1份樣品所得熒光光譜作為訓練集,用于建立識別方法,其余樣品的熒光光譜作為測試集,用于所建方法的驗證.1.3浮藻三維熒光光譜的主成分分析根據Delaunay三角插值法,消除浮游藻三維熒光光譜的瑞利散射和拉曼散射;然后將各浮游藻三維熒光光譜歸一化(以發射波長為680nm的激發光譜的平均熒光強度為基準);對各浮游藻的三維熒光光譜進行主成分分析,得到各主成分得分譜;利用Fisher判別分析方法對各主成分得分譜及其組合的分辨能力進行判別,選取分辨能力最佳的主成分得分譜或其組合作為赤潮藻的特征譜.以上工作利用Matlab6.5完成.1.4實驗用金屬酶的檢測利用選取的主成分得分譜或其組合,基于非負最小二乘法建立我國東海常見的11種赤潮藻的識別測定方法,并在實驗室進行方法有效性驗證.以上工作利用Matlab6.5完成.2結果與討論2.1熒光光譜的主成分分析水的散射峰(包括瑞利散射和拉曼散射)的存在顯著地降低了三維熒光光譜的定性和定量測定能力,特別是對于低含量樣品的分析干擾尤為嚴重.本研究利用Delaunay三角插值法消除散射的影響,即將散射峰切除,以散射峰鄰近區域保留的數據為基準進行三維插補,這種消除散射的方法要優于傳統的差減法.對訓練集的三維熒光光譜進行歸一化處理,以消除熒光光強的影響.對歸一化后的三維熒光光譜做主成分分析.主成分分析方法是尋求從高維空間到低維空間映射的方法,以便于用幾個較少的指標來綜合所研究目標總體各方面的信息,且這幾個指標所代表的信息不重疊.主成分分析所得的載荷矩陣是投影的線性空間,而得分矩陣是原始熒光光譜在線性空間的投影,因此筆者使用主成分得分譜作為特征譜.由于前3個主成分的累積貢獻已達85%以上,故僅用前3個主成分就可表示原熒光光譜的主要信息.通過對11種藻3個主成分得分譜圖的比對分析,發現前2個主成分得分譜具有一定的分類識別能力(圖1,甲藻為實線,硅藻為短虛線,黃藻和金藻為長虛線),并且特征具有較好的穩定性,而第3個主成分得分譜雖然也具有一定的區分識別能力,即不同藻種的第三主成分得分譜具有差異性,但是同1種藻在不同條件下測得的譜其第三主成分得分譜也具有顯著差異,并且這種差異往往超過了種間差異,故第三主成分得分譜已不宜作為識別特征譜.本研究將在第一和第二主成分得分譜中選擇識別特征譜.2.2主成分得分譜pseudo-nictsp.nFisher線性判別分析是1個快速的統計判別技術,它尋找由原變量線性組合成的新變量,這些新變量能夠盡可能地將目標從其他類別中分離出來.通過一定的運算規則產生n個用于判別的標量,第1個識別量是最大判別標量,第2個判別量次之,并且第3個判別量與第1個判別量正交,即不相關,依次類推.本研究利用第1(n1)和第2判別量(n2)對特征譜進行判別分析,以確定最佳的赤潮藻屬水平上的識別特征譜.從圖2可以看出,第一主成分得分譜無法分辨中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)和尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschiapungens),對角毛藻(Chaetoceros)、微小原甲藻(Prorocentrumminimum)和塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)的分辨能力較弱,而第二主成分得分譜恰好能夠彌補;第二主成分得分譜則無法分辨尖刺擬菱形藻(Pseudo-nitzschiapungens)和海洋卡盾藻(Chattonellamarina),對角毛藻(Chaetoceros)和東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)的分辨能力有限,而第一主成分得分譜則能夠很好地分辨這幾種赤潮藻.據此,本研究使用第一主成分得分譜和第二主成分得分譜作為赤潮藻屬水平上的識別特征.圖3為赤潮藻識別特征譜的Fisher判別分析.就實驗所用11種我國東海常見赤潮藻而言,所選特征譜具有穩定的可分辨差異.對比各藻不同生長期的特征譜,發現各生長期特征譜譜形基本相似,故將各藻不同生長期特征譜合并為1條譜.將各藻在不同光照條件下所得特征譜合并建立浮游藻熒光特征譜庫,用于在屬水平上對浮游藻的識別分析.2.3赤潮藻的熒光光譜識別通過浮游藻的特征譜識別赤潮藻的基本思想是找到與樣品特征譜最為相似的特征譜庫里的特征譜,可轉化為線性回歸問題,即以標準譜庫中的每1條特征譜對樣品特征譜進行擬合,誤差最小者的特征譜對應的赤潮藻即為識別結果.為使誤差最小,一般采用最小二乘方法,因未知待估參數不可能是負值,因此在運算中加以非負限制,使結果更加符合實際情況,即非負最小二乘法解析多元線性回歸模型.表2為11種赤潮藻在屬水平上的識別測定結果,赤潮藻的識別正確率≥85%,其中9種赤潮藻的識別正確率≥90%,特別是對于近幾年東海發生赤潮頻率極高的東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)和裸甲藻(Gymnodiniumsp.),識別正確率≥95%.從識別結果可以看出,該技術利用三維熒光光譜能夠較為準確地對11種赤潮藻在屬水平上進行識別測定.通過對識別錯誤的樣品進行分析發現,識別錯誤的浮游藻樣品基本都是培養前期(第3d)的樣品,而在這期間,多數藻的細胞密度較低.由于所用熒光分光光度計的靈敏度限制,使得赤潮藻的熒光光譜譜形無法完全顯現,這可能是造成識別錯誤的重要原因.3實驗結果與分析本研究將三維熒光光譜技術與主成分分析方法相結合,實現了對我國東海常見的11種赤潮藻的在屬水平上的快速識別測定,識別正確率≥85%,特別是對于近幾年東海發生赤潮頻率極高的東海原甲藻(Prorocentr