蛋白質檢測研究進展Contents1、蛋白質簡介2、蛋白質的檢測方法3、蛋白質與疾病的關系蛋白質簡介

蛋白質是由氨基酸脫水縮合形成的空間結構復雜的大分子有機物，其主要化學元素為C（約50%）、O（約23%）、N（約16%）、H（約7%）、S（約0~3%）。氨基酸是蛋白質的基本組成單位，蛋白質既具有氨基酸的部分理化特性，也具有其它有機物的一些共性以及眾多的自身獨有特點與性質：高分子、兩性解離及等電點、水合作用、變性作用、顯色反應（雙縮脲反應、Folin-酚反應、茚三酮反應、米倫反應、黃蛋白反應、乙醛酸反應、坂口反應、偶氮反應、考馬斯亮藍反應、氨基酸的α-氨基及α-羧基反應、）蛋白質的異常表達與體內多種疾病的發生發展息息相關

蛋白質的檢測方法傳統蛋白質檢測方法：免疫印跡法；酶聯免疫吸附試驗常規方法：物理法：紫外吸收法化學法：凱氏定氮法；比色法高效液相色譜法毛細管凝膠電泳法近紅外光譜法質譜法熒光法免疫印跡法（Westernblot）原理：蛋白樣品經過電泳分離后，轉移并固定于膜上，然后應用抗原抗體反應進行特異性檢測的方法。Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定相結合的特異性蛋白質的檢測方法免疫印跡法是檢測蛋白質混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法，也可以作為確定同一種蛋白質在不同細胞或同一種細胞在不同條件下的相對含量的半定量方法。免疫印跡法檢測樣品中特異蛋白質的基本流程樣品的凝膠電泳蛋白印跡封閉反應與特異性抗體（一抗）孵育與酶耦聯的二抗孵育顯色或化學發光顯影觀察和記錄結果酶聯免疫吸附試驗原理：酶聯免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbantassay，ELISA）是一種固相免疫測定技術，先將已知的抗原或抗體包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗原或抗體發生特異性反應。最后加入酶反應底物，根據底物被酶催化產生的顏色及其光密度（OD）值的大小進行定性或定量分析。優點：靈敏度高；特異性好；簡便；重復性好。ELISA和Western雜交都利用抗原抗體間的分子識別作用，借助不同的抗體分子標記實現蛋白質的檢測。紫外吸收法理論基礎：蛋白質分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280nm處具有紫外吸收，其吸光度與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的吸光度值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下蛋白質溶液的吸光度值與蛋白質濃度的正比關系可以測定蛋白質含量。優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收缺點:準確度較差、專一性差、干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾凱氏定氮法理論基礎：各種蛋白質的含氮量很接近，通常占其總重量的16％左右。蛋白質樣品用濃硫酸消化后，可以轉變為硫酸銨，硫酸銨中的NH4+與NaOH反應又可轉變為NH3，用硼酸液吸收后，可由標準鹽酸滴定并定量。凱氏定氮法由于蛋白質是體內的主要含氮物，因此，通過測定生物樣品的含氮量便可估算出樣品中的總蛋白質含量。蛋白質含量＝含氮量Х6.25此方法的測定范圍為0.2～1.0mg氮。優點：應用范圍廣，重現性好、準確度高缺點：局限于樣品中總蛋白的檢測，破壞蛋白質結構，易受到被測樣品中其它有機含氮化合物的干擾比色法-雙縮脲法原理：蛋白質含有兩個以上的肽鍵，故有雙縮脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）反應。在堿性條件下，肽鍵的質子被解離，Cu2+和失去質子的多肽鏈的氮相結合產生穩定的紫色絡合物，在540～560nm的光吸收值與蛋白質的含量在一定范圍內呈線性關系。由于與雙縮脲試劑與不同種類的蛋白質反應產物的顏色差別極小，使得該方法比較適合總蛋白質的檢測。優點：操作簡單、測量速度快缺點：靈敏度較差，精度不高比色法-Folin-酚試劑/Lowry法原理：1、蛋白質在堿性條件下與試劑甲（雙縮脲試劑）中的Cu2+形成絡合物。2、由于蛋白質含芳香族氨基酸殘基（如Tyr和Trp），生成的絡合物可還原試劑乙（Folin-酚試劑）中的磷鉬酸和磷鎢酸而產生鉬藍和鎢藍復合物，該復合物顯藍色，其顏色深淺與蛋白質濃度在一定范圍內呈線性關系，可用于定量分析。優點：反應靈敏，檢測限低，比較適合微量蛋白質的測量缺點：Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩定因而要求精確控制操作時間，且容易受去酚類、糖類、尿素等多種物質的干擾。此外，而不同的蛋白質的酪氨酸和色氨酸的含量不同，導致在不知道蛋白質種類的情況下測量結果存在部分偏差。比色法-BCA法BCA（Bicinchoninicacid)試劑的主要成分為二喹啉甲酸鈉。BCA并不能直接與蛋白質發生化學或是物理上的反應，而是對雙縮脲反應的強化。BCA極易與Cu+結合形成紫色的復合物，該復合物在562nm處有最大吸收峰，對入射光的吸收程度與Cu+的濃度成正比。比色法-BCA法優點：穩定性好、顯色靈敏度高，顯色靈敏度與Folin-酚法相當，且不受去垢劑、變性劑的影響缺點：反應速度慢，易受糖類、尿素、B2

巰基乙醇等物質的干擾，比Folin-酚法對糖類更加敏感比色法-考馬斯亮藍法理論基礎：1、考馬斯亮藍屬于三苯甲烷類染料，分為G-250和R-250兩種，是目前使用最為廣泛的一種蛋白質染色劑。2、考馬斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色，吸收峰位置為488nm左右，容易與蛋白質中的精氨酰和賴氨酰殘基結合，結合后顏色變為藍色，最大吸收峰的位置轉移到595nm。優點：結合穩定、反應速度快、顯色靈敏度高，操作簡便，不受酚類、游離氨基酸、絡合劑等成分干擾缺點：不同蛋白質中的精氨酰和賴氨酰殘基的含量不同，因此其與不同的蛋白質結合有強有弱，導致測量不同的蛋白質時存在較大偏差比色法-茚三酮法茚三酮，又名苯并戊三酮，溶于水后與水分子結合形成水合茚三酮，進而可與氨、一級胺、二級胺發生化學反應生成紫藍色或黃色縮合物。茚三酮法可用于水解蛋白質的檢測。比色法-茚三酮法以氨基酸為例，首先在弱酸性加熱條件下氨基酸與水合茚酸酮發生氧化反應，氨基酸脫去氨基和羥基變成醛類化合物，水合茚三酮吸收氨基并脫去分水子變成胺合茚三酮。隨后胺合茚三酮與茚三酮反應生成席夫堿，并最終形成紫藍色或黃、棕色化合物，產物顏色的深淺與蛋白質的濃度相關，最大吸收波長為570nm左右。優點：極高的顯色靈敏度和良好的檢出限缺點：水合茚三酮和不同的氨基酸顯色程度有所差異，蛋白質水解程度的不同容易對測量結果造成較大誤差。此外，茚三酮顯色劑的穩定性較差，不利于長期存儲高效液相色譜法原理：1、利用組分在兩相中的熱力學分配系數和動力學擴散系數差異來實現混合組分分離2、由于不同的物質的溶解度、蒸汽壓、吸附能力等物理化學性質存在差異，它們在流動相和固定相之間的分配系數有所不同，當兩相做相對運動時樣品組分在兩相之間進行多次連續分配，最終實現各組分的彼此分離優點：其分離柱壽命長、分離效率高、分析時間短、進樣量小、檢測靈敏度高

缺點：對組成單位相似、分子極性相近、分子大小不同的動植物蛋白組分分離效果不佳

近紅外光譜法原理：當紅外光照射樣品分子時，極性共價鍵選擇性地吸收某些波長的光后產生振動能級躍遷，吸收光子的頻率與躍遷前后的能量差相關，吸收的強度取決于化學鍵振動的非諧性。分子的基頻振動產生的吸收譜帶位于波長2500-25000nm的中紅外區域，發生780-1100nm的短波近紅外區1100-2500nm的長波近紅外區的吸收譜帶對應著基頻振動的倍頻和組合頻。含氫基團（X-H）的振動躍遷非諧性常數最高，其在有機物的近紅外吸收光譜中占主導地位。優點：絕大多數的有機物都有吸收響應，所以測量時幾乎無需進行樣品前處理缺點：吸收系數小，其檢測限通常不到0.1%，不利于對蛋白質的衡量分析質譜法原理：質譜分析法是將化合物形成母離子和碎片離子,根據離子的質荷比(m/z)進行分離,從而對化合物的成分和結構進行分析的方法質譜分析的一般過程是:樣品由合適的進樣裝置引入并進行氣化,氣化后的樣品進入離子源后被電離,電離后的離子經過適當加速后進入質量分析器,根據不同的m/z進行分離,到達檢測器,產生不同的信號,利用專業的生物軟件進行后續分析。優點：準確性高，靈敏度高，與傳統的生物學技術手段相比,基于質譜的蛋白質組學技術更適合于臨床疾病的研究缺點：技術發展不夠完善毛細管凝膠電泳法原理：電泳也稱作電遷移，是指溶液中帶電粒子在電場中所發生的遷移運動，運動的遷移率與組分分子的大小、極性、親和能力、等電點、相分配系數以及所帶電荷的多少等多個因素有關。毛細管電泳又稱為毛細管電分離，是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力、根據帶電粒子遷移率的不同來實現組分分離的一種液相分離技術。在毛細管內充滿凝膠介質的電泳稱為毛細管凝膠電泳。電泳過程中，不同分子在電場作用下發生電泳遷移時受到網狀凝膠的阻礙作用不同，使其遷移速度不同，最終被分離。優點：分離度極高，分離速度較快、樣品消耗量少（進樣量為nL級）缺點：分離檢測成本高，大分子容易積留、清洗困難，重現性差熒光法熒光探針具有靈敏度高，選擇性好，體積小，受生物體內活性小分子及金屬離子干擾小等優點基于小分子熒光探針檢測蛋白質小分子與蛋白質相互作用后可引起小分子熒光光譜和蛋白質自身熒光內源熒光光譜以及同步熒光光譜的變化,如熒光強度和偏振度的改變、新熒光峰的出現等,這些均可以提供小分子與蛋白質結合的信息。小分子與蛋白質作用引起體系熒光性質改變有兩種情況：小分子無熒光,在蛋白質溶液中加入小分子后,蛋白質的內源熒光淬滅小分子有熒光,蛋白質與小分子作用后,內源熒光被淬滅,而小分子的熒光被敏化增強基于蛋白質疏水作用：在水介質中球狀蛋白質的折疊總是傾向于把疏水性殘基包埋在分子內部而形成疏水空腔。疏水作用及親水和疏水平衡在蛋白質結構與功能方面起著關鍵作用。利用極性敏感有機小分子熒光探針與蛋白質結合前后基于其疏水空腔提供了一個非極性環境從而導致探針熒光性質的改變基于蛋白質與有機染料結合作用蛋白質與熒光染料結合后,能使溶液熒光強度增強或淬滅,并且其變化量與蛋白質濃度成正比。有機染料包括：血管黃素，曙紅Y，鉻天青S，溴酚藍，四羧基苯基卟啉，Evansblue，偶氮染料，方酸菁染料，酞菁染料等

曙紅Y鉻天青S溴酚藍四羧基苯基卟啉Evansblue偶氮染料方酸菁染料酞菁染料基于AIE機理檢測蛋白質此外，小分子熒光探針還可基于熒光能量共振轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET),光誘導電子轉移(photo-inducedelectrontransferPET）,分子內電荷轉移(Intramolecularchargetransfer,ICT)等效應對蛋白質進行選擇性識別基于自組裝機理檢測蛋白質

超分子化學：分子聚集體結構和功能為研究對象,旨在研究分子基于弱相互作用的組裝、自組裝和自組織行為,并研究這些行為可能帶來的結構和功能的改變,以期建立結構和功能之間的關系。超分子的組裝的實現依賴于分子間鍵.它包括氫鍵、范德華力、親脂-疏水作用、金屬離子的配位鍵、π-π堆積作用等PalapuravanAnees,etal.J.Am.Chem.Soc.2014,136,13233?13239比色/比率型熒光探針檢測蛋白質利用催化消除氨基甲酸酯保護基團合成了反應型探針，BSA的存在使得氨基萘二甲酰亞胺的綠色熒光增強，根據溶液顏色變化和熒光強度比值識別并定量檢測。X.Zhang.etal.Analyst,2011,136(19):4008-4012.基于熒光有機納米材料檢測蛋白質納米材料，是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（＜100nm）或由