水稻RACK1蛋白的定位研究

姓名：甄萍萍導師：梁建生專業:植物學

綜述

水稻是人類主要糧食作物之一，隨著國民經濟的發展和社會環境的改變，水稻生產受到越來越多的不利因素的限制，如病蟲害、環境污染、水資源的短缺等，嚴重制約了水稻的高產和穩產，所以必須進行品種改良，其中一個方向就是對水稻抗旱品種的開發研究。干旱脅迫可引起植物細胞一系列形態和生理生化響應，植物經過長期的進化，形成了一系列主動響應干旱脅迫的機制。植物細胞通過感受外界刺激將胞外信號轉化為胞內信號，進而調控相關基因表達，響應外界刺激。G蛋白偶聯信號轉導系統是重要的細胞信號轉導途徑，參與許多重要生命活動的調節響應，該系統中的G-蛋白就參與了植物響應干旱脅迫和信號轉導及基因表達等調節作用。

WD40重復蛋白是一個具有高度保守基序但具有多種功能的大家族。異三聚體G蛋白β亞基屬于WD40重復蛋白。Dell等通過酵母雙雜交的方法發現了G蛋白βγ亞基可能的新效應分子，即活性C激酶1受體(ReceptorforActivatedCKinase1,RACK1)、動力蛋白中間鏈和一個未知功能的蛋白質(GeneBank登陸號為AAH20044)。這些蛋白質都具有WD40重復。RACK1在廣大物種中是高度保守的；研究發現，哺乳動物和植物中都存在RACK1同源物的蹤跡，如豬、非洲爪蟾、鼠、大豆、山毛櫸等。ChenJG等(2006)在分析魚、昆蟲和真菌的EST數據庫和基因組時均發現了RACK1同源物。植物中第一個被發現的RACK1同源基因是煙草BY-2懸浮細胞中的一個生長素誘導基因arcA，之后在擬南芥、水稻、煙草、番茄、苜蓿和藻類中都發現了RACK1同源基因的存在。煙草和番茄中至少有兩種RACK1同源物。

報告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是一個其產物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調節序列融合形成嵌合基因，或與其他目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選轉化體。目前研究中曾用過的報告基因有:β-半乳糖苷酶(β-Lac),氯霉素乙酸轉移酶(CAT)、新霉素乙酞轉移酶(NPII)、熒光素酶(Lux)、和β-葡萄糖苷酶(β-GUS)等。但這些傳統的報告基因有著許多的不足。GUS基因所用的檢測底物成本較高，且會對細胞造成毒害，染色中的一些物理，化學步驟會損傷細胞的超微結構，其中間反應的擴增也會影響葡萄糖苷酶本身的在細胞內的準確定位;以熒光素酶基因作報告基因檢測時需加入熒光素，熒光素可在機體內隨質流移動，使其往往難以準確地指示熒光素酶基因的特異性表達部位;而β-半乳糖苷酶基因作報告基因需要外源底物X-gal和誘導物IPTG的參與，故成本高，且操作繁瑣。新霉素、氯霉素基因作報告基因的編碼產物對轉基因個體的幼胚存在一定的毒副作用。

綠色熒光蛋白(GFP)是存在于發光水母體內，它是一種吸收藍光或紫外光后發出綠色熒光的天然蛋白質。這種蛋白質在表達時可自身催化形成熒光基團，而且不需要添加任何底物或輔助因子，這樣它就可以免除在檢測時底物對細胞造成的一些物理、化學損傷，降低了添加的輔因子在對轉基因個體進行觀察時造成的假象，同時又降低了檢測成本，簡化了繁瑣操作。因此，在轉基因研究中，利用GFP作報告基因則可以大大提高轉基因動、植物的成功率，減少轉基因個體篩選、鑒定方面的工作量。植物基因工程的基本路線

(1)目的基因的分離(2)將目的基因克隆到適當的載體DNA中形成重組DNA，并且連接了一個控制目的基因轉錄表達的啟動子和一個控制目的基因轉錄終止的終止子，還連接一個編碼特殊蛋白質（如熒光蛋白）的標記基因。(3)利用細菌繁殖擴增重組DNA。(4)利用基因槍、農桿菌等方法將連接了啟動子和終止子的目的基因導入到目標植物的細胞中。(5)篩選含有外源基因的轉化細胞，并誘導產生轉基因植株。(6)大規模種植轉基因植物。選題意義

對擬南芥AtRACK1的研究表明，AtRACK1參與了植物對干旱脅迫信號的響應過程，并且與植物的忍耐干旱密切相關。與AtRACK1蛋白的氨基酸序列為模板對水稻基因組序列進行比對，我們找到兩個與編碼ATRACK1基因高度同源的基因（NP-916988和XP-475866）。在蛋白質水平兩者與ATRACK1蛋白的同一性和相似性分別達到70%和80%。推測水稻的RACK1（OsRACK1）可能與擬南芥RACK1（ATRACK1）具有相似的功能。

本實驗室以往的研究雖然證明rack1基因影響植物忍耐干旱的能力，通過研究水稻rack1過表達植株及突變體植株得知，OsRACK1與水稻抗旱能力成正相關，但對其機理不是很清楚。本研究試圖從OsRACK1基因產物在細胞中的定位區域來探討OsRACK1基因的作用機理。

研究方案

實驗采用與gfp構建融合基因，用熒光顯微鏡觀察的方法進行OsRACK1的定位研究。為了了解OsRACK1的亞細胞定位，構建rack1與gfp的融合基因，將融合基因構建成表達載體，另外再構建對照載體pCAMBIA1301-GFP。將兩個表達載體轉化水稻細胞進行穩定表達。使用熒光顯微鏡觀察GFP的綠色熒光來確定OsRACK1的亞細胞定位。研究技術路線目的基因rack1載體報告基因gfp載體轉基因表達載體的構建植物表達載體轉化根癌農桿菌根癌農桿菌介導的水稻轉化轉基因水稻的亞細胞定位檢測具體方法（1）表達載體的構建①rack1目的基因的克隆（T-A克隆）②gfp基因的克隆（T-A克隆）③pCAMBIA-RACK1-GFP融合基因表達載體和對照載體pCAMBIA-GFP的構建

用Kpn1和BamH1酶切rack1基因，用Spe1和Kpn1酶切gfp基因，將兩者插入至pCAMBIA1301的BamH1和Spe1酶切位點，構成重組質粒，即融合基因表達載體。

(2)植物表達載體轉化根癌農桿菌EHA105

采用凍融直接轉化法，將構建好的植物表達