生藥的有效性評(píng)價(jià)生藥的有效性評(píng)價(jià)

(Efficacyevaluation)

生物檢定法（Bioassay）

與療效相關(guān)聯(lián)的化學(xué)成分分析法(Analysisofbioactivecomponents)生藥的生物效應(yīng)評(píng)價(jià)法

定義：…它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)、生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，在嚴(yán)格控制的試驗(yàn)條件下，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品對(duì)生物體或離體器官與組織的特定生物效應(yīng)，計(jì)算供試品的效價(jià)（Potency）或者毒性（Toxicity）

，從而控制和評(píng)價(jià)供試品質(zhì)量或活性。。生藥的有效性評(píng)價(jià)方法之一：對(duì)一些采用理化方法不能測(cè)定含量或理化測(cè)定不能反映臨床生物活性的藥物。如胰島素、肝素、縮宮素及各種抗生素等。微量生理活性物質(zhì)。如Ach、5-HT某些有害雜質(zhì)的限度檢查如農(nóng)藥殘留量、內(nèi)毒素等致熱物質(zhì)、抗生素及生化制劑中降壓物質(zhì)的限度檢查等。應(yīng)用范圍：中藥及復(fù)方:中藥成分復(fù)雜，大部分中藥的有效成分尚未搞清，難以用理化方法加以控制，但可用一些以其療效為基礎(chǔ)的生物測(cè)定方法來(lái)控制其質(zhì)量。應(yīng)用范圍：Example1

洋地黃生物檢定法比較洋地黃標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)對(duì)鴿的最小公斤致死量，從而測(cè)定供試品的效價(jià)。死亡前有強(qiáng)烈顫抖、惡心嘔吐、排便等反應(yīng)。最后至瞳孔放大、呼吸停止為注射終點(diǎn)。抗凝血酶活性測(cè)定法：水蛭提取物牛纖維蛋白原+凝血酶(滴定)至有凝固物出現(xiàn)Example2水蛭抗凝血酶活性測(cè)定淀粉酶活力測(cè)定法：麥芽提取物淀粉+反應(yīng)，反應(yīng)終止麥芽糖Example3麥芽中淀粉酶活力測(cè)定a,b淀粉酶（底物）3，5-二硝基水楊酸棕紅色（540nm）生藥化學(xué)成分分析法生藥的有效性評(píng)價(jià)方法之二：

定義：應(yīng)用范圍：兩種評(píng)價(jià)方法的比較生物檢定法理化分析法測(cè)定結(jié)果能直接反映藥物的效價(jià)；是理化分析法的有力補(bǔ)充測(cè)定結(jié)果誤差較大，重現(xiàn)性較差；加上測(cè)定費(fèi)時(shí)，計(jì)算繁瑣；難以構(gòu)建合適的藥理模型以反映中藥整體作用的特點(diǎn)測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，易于控制與推廣測(cè)定結(jié)果與活性之間的相關(guān)性差MethodsAdvantagesDisadvantages一、紫外-可見(jiàn)分光光度法

(Ultraviolet-visiblespectrometry)朗伯-比爾定律:A=ECL

1、原理：?jiǎn)紊廨椛浯┻^(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度成正比。雙光束掃描掃描范圍：190nm~800nm常量池（3ml）和微量池（50～120ul）配置UVProbo軟件操作系統(tǒng)在操作系統(tǒng)控制下，可完成紫外可見(jiàn)光譜掃描、動(dòng)力學(xué)測(cè)定、單波長(zhǎng)和多波長(zhǎng)的定量分析、數(shù)據(jù)圖形處理以及規(guī)范化報(bào)告生成。

島津2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)2、儀器3、紫外-可見(jiàn)分光光度法定量方法對(duì)照品比較法吸收系數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)曲線法適用對(duì)象:

生藥中大類成分的含量測(cè)定，如總黃酮、總蒽醌、總生物堿等。4、應(yīng)用槐花（米）中總黃酮的比色法測(cè)定：藥材提取物＋亞硝酸鈉＋硝酸鋁＋氫氧化鈉500nm處測(cè)定平貝母中總生物堿的含量測(cè)定—酸性染料比色法藥材總生物堿pH5溴百里香酚藍(lán)

比色法測(cè)定412nm二、色譜法

(Chromatography)

薄層色譜法

(thinlayerchromatography,TLC)

氣相色譜法

(gaschromatography,GC)高效液相色譜法

（highperformanceliquidchromatography,HPLC）（一）薄層色譜法

(thinlayerchromatography,TLC)

薄層板(plate)點(diǎn)樣(loading)展開(kāi)(developing)顯色與檢視(visualization&detection)記錄(recording)1、TLC一般操作程序在計(jì)算機(jī)控制下，可自動(dòng)完成點(diǎn)樣－展開(kāi)－顯色－掃描－照像－彩色圖片輸出等一整套工作程序。瑞士CAMAG薄層色譜掃描儀2、TLC儀器《中國(guó)藥典》(2010年版)一部薄層色譜法用于定性鑒別的達(dá)2000多項(xiàng)。多用于鑒別、限量檢查:3、TLC的應(yīng)用斑點(diǎn)顏色、Rf值

依據(jù)簡(jiǎn)便、快速、適應(yīng)性廣、可操作性強(qiáng)

優(yōu)勢(shì)薄層掃描法定量（TLCS）3、TLC的應(yīng)用（定量分析）酸棗仁中酸棗仁皂苷A、B的TLCS法測(cè)定3、TLC的應(yīng)用（定量分析）薄層色譜－紫外可見(jiàn)分光光度法定量（TLC-UV）點(diǎn)樣展開(kāi)定位刮板洗脫UV測(cè)定（二）高效液相色譜法

（highperformanceliquidchromatography,HPLC）1、HPLC儀Agilent1100SeriesHPLCSystems

硅膠---正相色譜化學(xué)鍵合硅膠---反相色譜離子交換填充劑---離子交換色譜凝膠---分子排阻色譜手性鍵合填充劑---對(duì)映異構(gòu)體拆分色譜柱2、HPLC儀組成

紫外檢測(cè)器(ultravioletdetector,UVD)

二極管陣列檢測(cè)器(diodearraydetector,DAD)

熒光檢測(cè)器(fluorescencedetector,FLD)

電化學(xué)檢測(cè)器(electrochemicaldetector,ECD)選擇性檢測(cè)器檢測(cè)器－2、HPLC儀組成示差折光檢測(cè)器(refractiveindexdetector,RID)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporativelight-scatteringdetector,ELSD)質(zhì)譜檢測(cè)器(massspectrometricaldetector,MSD)

通用型檢測(cè)器

檢測(cè)器－2、HPLC儀組成Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器Agilent液質(zhì)聯(lián)用儀3、HPLC定性方法min01020304050mAU010203040506070三個(gè)定性參數(shù):tR值、UV、MSnm200225250275300325350375mAU0255075100125150UVm/z100200300400020406080100211.1189.1399.2227.1[M+Na]+[M+K]+[2M+Na]+[M+H]+MS內(nèi)標(biāo)校正因子法：外標(biāo)法：面積歸一化法：純度檢測(cè)《中國(guó)藥典》(2010年版）一部應(yīng)用HPLC法測(cè)定含量的中藥品種達(dá)1700余項(xiàng)。

HPLC優(yōu)勢(shì)：4、HPLC定量方法5、HPLC的應(yīng)用7-epi-loganin(1)sweroside(2)loganin(3)7-epi-vogeloside(4)secoxyloganin(5)1.金絲桃苷；2.異槲皮苷1.金絲桃苷；2.異槲皮苷1.金絲桃苷；2.異槲皮苷UPLC的原理：vanDeemter方程UPLC1.7umParticle2004’sUPLC的優(yōu)勢(shì)高分離度高速度高靈敏度AgilentRRLCShimadzuUFLCAgilent6890N型氣相色譜儀（三）氣相色譜法

（Gaschromatography,GC）1、GC儀載氣：H2、N2、He進(jìn)樣系統(tǒng)：溶液直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣色譜柱：彈性石英毛細(xì)管柱柱溫箱：恒溫和程序升溫檢測(cè)器：2、GC儀組成彈性石英毛細(xì)管柱不銹鋼填充柱涂壁毛細(xì)管柱載體涂層毛細(xì)管柱2、GC儀組成色譜柱檢測(cè)器火焰離子化檢測(cè)器(flameionizationdetector,FID)熱導(dǎo)檢測(cè)器(thermalconductivitydetector,TCD)氮磷檢測(cè)器(nitrogen-phosphorusdetector,NPD)火焰光度檢測(cè)器(flamephotometricdetector,FPD)電子捕獲檢測(cè)器(electroncapturedetector,ECD)質(zhì)譜檢測(cè)器(massspectrometricdetector,MSD)2、GC儀組成3、GC定性方法兩個(gè)定性參數(shù):tR值、MS4、GC定量方法內(nèi)標(biāo)校正因子法外標(biāo)法面積歸一化法標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法《中國(guó)藥典》(2010年版)氣相色譜法用于中藥分析的品種有50余種。5、GC法的應(yīng)用Pogostemoncablin中patchoulialcohol、pogostone的測(cè)定高效毛細(xì)管電泳

(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)毛細(xì)管電色譜

(capillaryelectrochromatography，CEC）液相色譜與核磁共振聯(lián)用(LC-NMR)LC/NMR/MS（四）其他色譜法

（Miscellaneouschromatography）HPCEHPLC-MS三、定量分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

(Validationoftheanalyticalmethod)目的：證明采用的分析方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。方法驗(yàn)證用于：

建立新的分析方法時(shí)原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)(一)驗(yàn)證內(nèi)容線性及范圍（linearityandrange）準(zhǔn)確度(accuracy)專屬性（specificity）精密度（precision）重復(fù)性（repeatability）重現(xiàn)性（reproducibility）檢測(cè)限及定量限（limitofdetectionandquantification）耐用性(robustness)1、線性（linearity）和范圍（range）線性是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物質(zhì)濃度直接呈正比關(guān)系的程度。范圍系指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。(二)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)線性（linearity）和范圍（range）AnalytestRCalibrationcurver2

testrange

mg/ml線性（linearity）和范圍（range）2、準(zhǔn)確度(accuracy)準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率(％)表示；回收率%=（實(shí)測(cè)值-供試品所含被測(cè)成分量）/加入對(duì)照品量對(duì)照品藥材量（g）藥材中對(duì)照品含量(mg)加入量(mg)測(cè)得總量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

貝母素乙

1.00550.67870.66401.325397.4100.42.941.00040.67530.66401.34391.00020.67510.66401.35741.00050.67530.66401.33891.00060.67540.66401.320497.11.00020.67510.66401.3698104.6準(zhǔn)確度(accuracy)--加樣回收率100.7102.899.9對(duì)照品藥材量（g）藥材中對(duì)照品含量(mg)加入量(mg)測(cè)得總量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)

丹酚酸B0.15018.72高9.9718.88101.9100.9±2.62.60.15008.7210.0118.98102.50.15028.7310.0518.92101.40.14998.71中17.53101.80.15018.7217.60102.60.15038.7417.63100.00.14988.71低6.9715.98104.30.15018.726.5615.1497.80.14998.716.6715.1095.7準(zhǔn)確度(accuracy)--加樣回收率8.668.658.893、專屬性（specificity）專屬性系指在其他成分可能存在時(shí)，采用的方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的特性。專屬性常用的試驗(yàn)方法:

空白陰性對(duì)照試驗(yàn)比較同一分析系統(tǒng)對(duì)照品與供試品相應(yīng)色譜峰的吸收光譜色譜-質(zhì)譜聯(lián)用驗(yàn)證待測(cè)成分忍冬苷

木犀草苷

蘆丁金絲桃苷木犀草苷忍冬苷金絲桃苷蘆丁2005年版中國(guó)藥典分離條件下木犀草苷與忍冬苷共流出對(duì)照品對(duì)照品金銀花中忍冬苷（MW594)和木犀草苷(MW448)提取離子流圖忍冬苷木犀草苷MW594MW448新方法(2010年版中國(guó)藥典)對(duì)照品的分離圖蘆丁金絲桃苷綠原酸忍冬苷木犀草苷對(duì)照品樣品UVMSUVMS采用HPLC-DAD-MS聯(lián)用技術(shù)，測(cè)定待測(cè)色譜峰的紫外吸收光譜及質(zhì)譜來(lái)判斷色譜峰的純度，確保分析方法的專屬性。4、精密度（precision）精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度。精密度通常包括以下三個(gè)方面的含義：重復(fù)性(repeatability):批內(nèi)精密度（intra-assayprecision）中間精密度(intermediateprecision)

重現(xiàn)性(reproducibility)中間精密度表示方法

日內(nèi)精密度(intra-dayvariability)日間精密度(inter-dayvariability)濃度日內(nèi)精密度（n=6)日間精密度（n=3)峰面積（X）X±SDRSD(%)峰面積（X）X±SDRSD(%)137mg/mL6265.06373.3±751.26351.86351.3±681.16299.76385.36282.46400.96431.36419.76457.627.4mg/mL1315.81302.3±131.01294.81322.6±312.41317.21284.01316.51291.41299.41356.61305.813.7mg/mL489.3493.5±3.80.76490.0498.6±142.9490.5493.3490.6497.4498.7515.2492.0重復(fù)性（repeatability）重復(fù)性是指在同一條件下對(duì)同一批樣品，從樣品供試品制備開(kāi)始，制備至少六份以上供試品溶液(即n>6)，或設(shè)計(jì)3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備3份供試溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。樣品質(zhì)量(g)丹酚酸B（％）丹參酮ⅡA（％）高0.50055.7485±0.03250.4540±0.00230.50045.6514±0.06430.4594±0.00210.49995.7763±0.00820.4529±0.0007中0.30035.8647±0.01350.4575±0.00110.30035.7112±0.03530.4539±0.00290.30065.6947±0.02320.4430±0.0021低0.19995.8618±0.07040.4751±0.00230.20056.0239±0.01170.4489±0.00290.20015.9838±0.05090.4502±0.0096平均值±SD(%)5.8129±0.12980.4550±0.0090RSD(%)2.2