熒光傳感微球材料的研究現狀與展望

盡管廣相廣相廣播儀的應用靈活，并且具有很高的靈敏度和選擇性，因此受到人們的高度重視。然而，廣相廣播儀的缺點也限制了其應用，因為很難完全組件化，只能一次性使用，并且容易污染試驗系統。另一方面，熒光薄膜傳感器和熒光微球傳感器基本上克服了這些缺點，近年來引起了人們的廣泛關注。例如，reinhoudt等人、蝙蝠、swag等人、模型等人和其他工作圍繞著熒光膜傳感器進行了大量工作，并取得了令人興奮的成果。然而，由于透射性和基本單元效應，溶液中使用的廣受歡迎微球傳感器的靈敏度一般不高，這限制了實際應用。與固體微球相比，微-納米級微球的表面更大。作為廣觀傳感器的載體，它可以有效地提高傳感器分子的固定量，改善傳感器材料的滲透性，顯著提高傳感器的靈敏度。此外，當以超順磁性微球為載體時，這些傳感器可以很容易地分離、重復使用，這不僅使人們重視膜廣觀傳感器的研究，而且非常重視微球傳感器的研究。正如膜傳感器一樣，微球傳感器通常以小分枝作為傳感器活動的分子，這主要是因為熒光方法具有高度的滲透性，并且可以收集信息（如熒光強度、熒光光譜形狀、各向異性、熒光壽命等）?？紤]到熒光微傳感器的研究重要性，本文簡要介紹了闡明微球傳感器的研究進展情況。1熒光傳感微球由于二氧化硅微球制備方法簡單,價格低廉,易于表面修飾,使其成為理想的微球傳感器支撐材料.Lin等以MCM-41型介孔SiO2微球為基質,用鄰苯二甲醛對其巰基化表面進行修飾生成OPTA(o-phthalichemithioacetal),利用OPTA與含氨基化合物反應后生成具有強熒光的異吲哚這一性質,合成了該類化合物的傳感微球材料M1(圖1).實驗發現,M1對多巴胺的響應速度比對氨基葡萄糖的響應速度快至少10倍,利用這一動力學差異可以分別測定生物活性分子多巴胺和氨基葡萄糖.值得注意的是,多巴胺分子和氨基葡萄糖分子大小相近,在均相溶液中與OPTA的反應活性也基本相同,因此,這種響應差異可能不是來自于載體孔道的屏蔽作用,而是由于含有大量羥基的氨基葡萄糖與Ml內壁羥基的強偶極作用抑制了其在載體孔道中的擴散速度,因此M1對其響應較慢.多巴胺和谷氨酸是兩種必不可少的神經遞質,在生命過程中發揮著重要的作用,由于兩者在神經細胞中同時存在,難以對其分別測定.Lin等以聚乳酸(PLA)包覆傳感微球M1(參見圖1),合成了能夠區分細胞外多巴胺和谷氨酸的傳感微球.實驗表明:多巴胺可以快速穿過PLA層并與OPTA反應,產生較強的熒光信號,而谷氨酸和酪氨酸等難以通過PLA層,與OPTA反應困難,熒光增敏現象出現較慢.在這一區分測定過程中,PLA膜層發揮了“門衛”作用(gate-keepingeffect).他們將這種“門衛”作用歸因于PLA與谷氨酸和酪氨酸等之間較強的相互作用,這種作用的存在也得到了以裸露M1所進行的對比實驗的證明.Tan等設計合成了一種能檢測牛肉沫中大腸桿菌的SiO2納米傳感微球.他們將熒光染料釕聯吡啶(RuBpy)摻雜在SiO2納米顆粒中,然后將能與大腸桿菌表面抗原特異作用的抗體化學結合在其表面,通過觀察體系熒光變化就可以檢測大腸桿菌.這種微球傳感器利用信號放大效應克服了傳統細菌擴增法耗時費力的缺點,使得大腸桿菌的檢測變得簡單易行.在這種方法中,一個細菌可以結合數千個納米顆粒,而一個納米顆粒又可以攜帶數千個熒光活性分子,這樣信號可以成千上萬倍地擴大.除了這些優點之外,在微球傳感器表面還可以同時結合多種抗體,使得多種細菌的同時檢測成為可能.雖然利用熒光增強作用對蛋白質進行定量測定已經成為蛋白定量的通用方法,但這種方法存在的光漂白和信號弱等缺點一直未能很好解決.以半胱氨酸修飾納米ZnS顆?？梢缘玫剿苄詮秃蟌nS微球材料,該熒光微球可以用作蛋白質的檢測探針.以同步掃描技術(Δλ=190nm)進行蛋白質檢測,發現蛋白質存在時,體系在267nm處出現強熒光,利用這一信號可以實現蛋白質的靈敏檢測.除此之外,該法還具有檢測無毒、檢測信號穩定、檢測范圍寬等優點.相對于熒光增敏,猝滅型熒光微球傳感器使用得更多.多年來,MIT的Swager等一直致力于微痕量硝基芳烴類化合物的熒光檢測,他們合成了一系列類似于圖2所示的共軛熒光聚合物,據稱這類熒光聚合物具有分子導線或“一點接觸,多點響應”效應,因此熒光量子產率高,對猝滅劑存在敏感,用其加工制備的傳感器優點突出.以這類共軛熒光聚合物為活性成分的薄膜傳感器或微球傳感器的傳感性能與待檢測物質在涂層中的通透性關系極大,因此在設計合成這類聚合物時要在其側鏈上連接大基團,防止主鏈相互聚集,在涂層中形成分子通道,提高相關傳感器的傳感特性.例如,將這種聚合物沉積在能吸附溶液或土壤中硝基芳烴類化合物的聚合物微球上,得到能夠探測微痕量硝基芳烴類化合物的熒光傳感微球材料,這類微球被稱之為“智能沙子”(smartsand)(圖3).王柯敏等也利用分子導線聚合物的信號放大效應,根據氰離子加入前后聚合物熒光發射強度的變化較好地實現了對氰離子的選擇性檢測.多巴胺在中樞神經系統的信息傳遞方面扮演十分重要的角色,它的濃度與帕金森、神經分裂等重要疾病密切關聯,因此對其精確檢測意義重大.Raymo等報道了一種多巴胺的快速可靠熒光探針檢測法,他們用硅烷化試劑預先處理SiO2微球,然后使其與熒光活性陽離子2,7-二氮雜芘的衍生物結合,得到了一種熒光傳感微球材料(圖4),缺電子的熒光分子與富電子的多巴胺分子結合導致微球熒光急劇猝滅,從而顯示多巴胺的存在.Rosenzweig等將光澤精(一種能夠特異識別鹵素離子的熒光染料分子)標記的磷脂膜共價固定于聚苯乙烯微球表面,制備了氯離子熒光傳感微球材料,利用此熒光傳感微球可以在線檢測人體血液中氯離子濃度.Kopelman等將一種熒光素衍生物共價結合于金膠體顆粒表面,制備了對NO特異傳感的熒光微球材料.NO的吸附使得熒光素在微球表面的取向發生變化,從而微球熒光強度降低,據此可以測定白鼠巨噬細胞內的NO含量.光誘導電子轉移(photo-inducedelectrontransfer,PET)是一種重要的光物理過程,也是熒光猝滅的一種特殊形式.將PET過程用于傳感微球設計,可以進一步豐富熒光傳感微球的設計思路.Ayadim等用末端為氨基的硅烷化試劑處理SiO2微球,然后將其再與氯甲基蒽反應,得到一種對pH敏感的熒光微球材料.當該微球處于酸性環境中時,因質子化封閉了連接臂N原子上的孤對電子,使得導致熒光猝滅的PET過程無法發生,體系熒光增強.相反,在堿性環境中,N原子上孤對電子可以參與PET過程,使體系熒光猝滅.這樣根據體系熒光強度的變化就可以實現pH的測定.更為有趣的是,當將蒽以較高密度固定到微球表面時,微球對溶液pH變化不再敏感,而對有機溶劑中微量水的存在卻異常敏感,利用這一現象可以實現非水體系中痕量水的半定量測定.王輝等利用溶膠-凝膠法制得了納米SiO2微球,利用表面反應將萘化學固定于微球表面(如圖5),發展了一種超靈敏銅離子熒光微球傳感器.綜上所述,基于微球的熒光強度變化的熒光傳感器具有原理簡單、現象易于觀察等優點,在實際工作中易于應用.但對許多復雜體系而言,這類熒光微球傳感器因抗干擾能力弱而難以應用,因此,出現了比例型熒光微球傳感器.2熒光傳感微球傳感器Montalti等將丹磺酰共價結合于SiO2微球表面(圖6),以微酸性溶液處理所得微球,得到表面結合丹磺酰部分質子化的微球材料.實驗發現,質子化的丹磺酰光物理行為與未質子化的丹磺酰很不相同,兩者可以被選擇性地激發.實驗還發現,因參與能量轉移和電子轉移,這兩種形態之間可以發生相互作用.質子化強烈猝滅丹磺酰修飾SiO2微球的兩種熒光發射,這一過程與溶劑極性關系極為密切,據此可以對微球微環境極性進行靈敏檢測.作者預期這一發現將在設計制備新型熒光傳感材料方面獲得應用.Bakker等將熒光手段與陰離子-質子共萃取機理相結合,設計制備了以塑化聚氯乙烯微球為載體,尼羅蘭衍生物(ETH5294,圖7)為傳感元素的兩類對特定離子具有選擇性識別能力的熒光傳感微球材料.在第一類微球材料中,微球表面只有尼羅蘭ETH5294.利用質子化ETH5294及其非質子化ETH5294發射光譜位置的差異,依靠兩個熒光發射相對強度的變化可以實現對某些陰離子的選擇性識別.該微球對陰離子的選擇性取決于被萃取陰離子的水合焓.在第二類微球材料中,微球表面除了化學結合ETH5294外,還擔載有能夠特異識別鉀離子、鈉離子和鉛離子等的離子載體,從而實現對多種金屬陽離子的選擇性識別.以這些熒光傳感微球為檢測試劑,結合流動細胞技術可以對細胞中有關離子進行快速分析.Cai等制備了溫度響應型熒光微球傳感器.這種熒光傳感微球的化學本質是鉺摻雜氟化玻璃微球,這種微球具有上轉換熒光性質.其中位于522和546nm的熒光分別來自鉺的4S3/2和2H1/2激發態.以兩者強度比值為參量,可以在150—850K范圍內對溫度進行比較精確的測定,分辨率可達lK.相對于其他玻璃或光纖溫度傳感器,這種微球溫度傳感器具有容易制備、成本低、測量簡單、結果可靠等優點,如果調整微球尺寸,還可以進一步擴展微球的溫度測量范圍.Rotello等將2,6-二(N-乙酰胺基)吡啶和芘同時共價結合于金膠體顆粒表面,實現了對核黃素的選擇性識別.2,6-二(N-乙酰胺基)吡啶有多個氫鍵結合位點,可以和核黃素形成氫鍵,而芘與核黃素可以發生π-π相互作用,這兩種作用的存在使得膠體金顆粒表面對核黃素具有特異結合能力(圖8).除上述單熒光物種標記傳感微球外,將兩種熒光物種同時標記于微球表面,利用被檢測物質加入前后兩者熒光發射相對強度的變化,也可以實現對待測組分的檢測.由Kopelman等提出的生物定位包埋探針(probeencapsulatedbybiologicallylocalizedembedding,PEBBLE)技術備受人們重視,這種技術的核心是用熒光染料對納米顆粒進行標記,根據熒光染料與被測物質結合前后熒光強度等的變化來檢測被測物質的存在.利用這種技術可以測定單個細胞的pH、細胞內外鈣離子濃度等.除此之外,這種技術還具有選擇性高、可逆性好、響應時間短等優點.在此基礎上,Kopelnan等還設計制備了對活細胞內鎂離子選擇性傳感的熒光微球傳感器,其中標記所用熒光試劑為香豆素343和Texas紅.選擇香豆素343的原因在于其可以選擇性結合鎂離子,而Texas紅僅被用作參考熒光物質.實驗表明,鈣離子、鈉離子、鉀離子等的存在均不干擾測定.與自由態熒光相比較,微球熒光基本不受非特異性吸附蛋白的影響.此外,這種熒光微球傳感器表面還可以鍵合諸如配體、特異蛋白、DNA等多種生物分子,這樣根據測定對象可以選擇合適的生物分子對其表面實施修飾,得到對特定生物物質敏感的熒光傳感微球.不難看出,這類熒光微球傳感器在生物醫學檢測,特別是在單個活細胞生物醫學檢測中將獲得重要應用,顯示出很好的應用前景.巨噬細胞對病毒或細菌的吞噬作用是機體對外來感染的免疫應答.吞噬作用發生后細胞會分泌溶菌酶、膠原酶、酸性水解酶等,溶菌酶的pH值可作為其活性標志,同時亦表現出吞噬細胞的活性.Rossenzweig等將pH敏感染料Oregon綠和非pH敏感染料Texas紅共價結合到帶有大量氨基的亞微米聚苯乙烯微球表面,制備了對白鼠巨噬細胞內溶菌酶的pH敏感的熒光傳感微球,利用這種微球研究了氯喹對細胞內溶菌酶分泌的影響.實驗發現,隨pH升高,Oregon綠與Texas紅的熒光強度比值增大,利用這一比值作為參量實施測定較之單用Oregon綠要好得多,可以有效補償儀器漂移、傳感器位置移動以及其他因素所引起的測定誤差.此類熒光傳感微球的缺點在于熒光試劑暴露于測試環境中,易于受到干擾.當氯喹濃度達到100μmol/L以后,測定結果出現較大偏差.為此,Rosenzweig等將熒光素和四甲基羅丹明雙標記的磷脂共價結合于帶有大量羧基的聚苯乙烯微球表面,制得了對溶菌酶pH敏感的新的熒光微球材料.在這一材料中,四甲基羅丹明為參考熒光物質,熒光素則為對pH敏感的熒光試劑,微球的pH響應范圍為5.5—7,最小分辨率可達0.1個pH單位.由于許多蛋白質分子的直徑、細胞膜的厚度和多亞基蛋白質位點間的距離多在2—6nm之間,與熒光共振能量轉移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)的特征Frster距離相近,因此FRET技術在生物物理研究中獲得了廣泛應用.Rosenzweig等利用FRET技術和碳水化合物對凝集素分子的特異選擇性結合實現了對碳水化合物及糖蛋白的傳感.具體過程是將熒光素標記外源凝集素分子吸附在聚苯乙烯微球表面作為給體,以Texas紅標記葡聚糖分子為受體,當體系中存在碳水化合物或糖蛋白時,其與外源凝集素分子結合,占據葡聚糖分子的結合位點,導致FRET效率降低.根據碳水化合物與糖蛋白結合能力的不同,可以定量區分這兩類物質在溶液中的濃度.Steemers等利用FRET原理設計了一種分子信標,并將其連接到光纖陣列斷面(圖9),用于檢測特定寡核苷酸序列.在這種分子信標的末端連接著熒光物種F,另一端連接有猝滅劑分子Q,連接臂則為一段具有特定序列的寡核苷酸,連接臂內部的寡核苷酸通過配對形成發夾結構,當沒有目標DNA分子時,F與Q相互靠近,F的熒光被猝滅,體系無熒光信號或熒光信號很弱;當出現目標分子時,發夾結構展開,F與Q相對遠離,體系發出熒光.很顯然,與強度變化型熒光微球傳感器不同,比例型熒光微球傳感器是以兩種熒光物種的熒光強度之比或同一熒光物種的兩個不同熒光發射的強度之比作為參量進行檢測,這樣不僅可以減小測定誤差,增加測量的準確性,而且可以有效避開環境因素干擾,拓寬微球類熒光傳感器的實際應用.3光纖傳感微球將熒光傳感微球分散于待測溶液中,根據微球熒光信號的變化檢測待分析物是最常用的熒光傳感微球使用方法.例如,Swager等研制的“智能沙子”就以這種方法獲得應用.然而,如果不解決熒光微球傳感器的重復使用問題,它就很難獲得實際應用.基于這一考慮,人們提出以超順磁性微球作為熒光活性物質載體制備熒光傳感微球.例如,Qiu等以包覆有苯乙烯和馬來酸酐共聚物的超順磁性Fe3O4/鄰苯二甲酸銪熒光微球為載體,將肝磷脂共價結合在其表面,不但解決了傳感微球的分離和重復使用問題,而且還提高了微球的生物相容性,擴展了傳感微球的使用范圍.除了以上述途徑解決熒光傳感微球的分離和重復使用問題外,通過集成化,也可以解決這一問題.事實上,集成化還可以使此類熒光傳感微球更加易于器件化和儀器化.將光纖作為微球材料集成化的載體,可以實現對特定成分的遠距離傳感.Walt等利用光纖將具有不同傳感性能的微球材料集成化,依靠熒光成像技術實現了對樣品中多組分的同時檢測.他們將纖維末端浸于HF溶液中,利用光纖芯和包皮材料對HF反應的不同在光纖斷面上形成微井(microwell),然后將已經預先功能化的微球隨機置于微井中,組裝成具有如圖10所示的具有特殊結構的光纖熒光微球傳感器.很顯然,這種光纖熒光微球傳感器的充分使用有賴于對不同類型熒光傳感微球的有效識別,以使熒光測量系統能夠辨別它們.為了實現對不同傳感微球的編碼,通常以菁染料DiIC(indodicarbocyanine)和Texas紅染料TRC(Texasredcadaverine)對相關微球進行雙標記,這是由于兩者可同時被577nm光源激發,并在670和610nm處形成各自的最大發射峰.這樣,以不同比例的DiIC和TRC標記不同種類傳感微球,就可以達到對這些微球進行編碼識別的目的.以雙標記微球為載體,對其表面進行修飾就可以得到對不同待分析物敏感的熒光傳感微球材料.以這些傳感微球為檢測材料,利用特殊的檢測儀器或系統就可以實現對樣品中多種成分的同時測定.事實上,利用活細胞對pH,O2以及CO2敏感的性質設計制備的光纖熒光微球傳感器已經成功用于對細胞新陳代謝過程的檢測,這種檢測具有快速、可重復和非侵害性等特點.實際