SPIO介導eNOS基因轉染內皮祖細胞及其磁共振成像的實驗研究研究生

聶

芳導

師

滕皋軍

教授東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11研究背景－內皮祖細胞血管內皮祖細胞(endothelial

progenitor

cell,EPC)：血管內皮細胞的前體細胞特點：具有干細胞的特性：自我更新、高度增殖能力來源相對容易：臍帶血、成體外周血、骨髓在內皮損傷或功能不全的修復中起重要作用，可逆轉失調的內皮功能EPC進入體內后，有定向歸巢特性－自體EPC移植無免疫排斥性東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11研究背景－內皮祖細胞因此，EPC成為基因治療的理想靶細胞，可同時進行定向基因治療和細胞治療，這可能成為缺血性疾病、血管再狹窄等血管內皮再生療法的理想方法。東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11兔外周血內皮祖細胞分離培養：a:培養3天后貼壁的小圓細胞。b:一周后部分小圓細胞呈梭形改變。c、d:21天后呈內皮細胞樣改變。東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11研究背景－eNOS基因東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11通常認為內皮功能失調是指內皮衍生的NO生成、釋放減少和/或活性降低。內皮型一氧化氮合酶(eNOS)是NO合成的限速酶，是調節NO合成的重要環節。eNOS基因的轉染可提高NO的生物學活性，進而擴張血管，抑制血小板及內皮細胞間的黏附，抑制血管平滑肌細胞增殖，增強血管壁的抗動脈粥樣硬化特性，從而用于治療動脈粥樣硬化、血管成形術、支架術后再狹窄等。eNOS基因內皮祖細胞橋梁－基因載體東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11基因治療的關鍵載體的選擇東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11研究背景－基因載體傳統載體：病毒載體－轉染效率高、但制備困難、免疫反應、潛在致癌性、目的基因容量小、靶向特異性差非病毒載體－細胞毒性低、制備方便、但轉染效率較低、其顆粒大小是影響轉染效率的重要因素東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11研究背景－基因載體東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11新型載體：磁性納米粒子，其中納米超順磁性氧化鐵(SPIO)因可同時作為基因載體和MR示蹤劑而受到關注。SPIO介導基因轉染細胞的原理：SPIO表面修飾陽離子聚合物PLL后帶正電荷，通過靜電作用與質粒DNA形成復合物，被細胞內吞進入細胞。東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11SPIO作為基因載體的優勢：－無免疫原性、低毒－具有較高的基因轉移效率－可保護基因不易受到各種酶的消化－可介導外源基因在宿主細胞染色體DNA中整合，從而獲得長期穩定的表達－準確的靶向性－制備容易、粒徑較小、性質穩定東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11SPIO作為MR示蹤劑的優勢：實現了分子成像：活體實時示蹤、無創

弛豫率約為Gd3+的7～10倍，在很低的濃度時(nmol級)即可在MR上形成對比粒徑小，穿透力強生物可降解，安全東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11研究內容外周血來源EPC體外誘導、培養及擴增；以納米SPIO作為基因轉染載體，從質量比、質量濃度、轉染 時間等多方面探討SPIO攜帶基因轉染EPC的最優條件；評價轉染前后EPC的功能、活力、凋亡及細胞周期；評價轉染前后eNOS基因的表達情況利用SPIO的超順磁性進行轉染后不同濃度細胞群的MR成像， 評價SPIO同時作為基因載體和MR細胞對比劑的可行性。東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11關鍵問題納米SPIO作為基因載體轉染EPC的最佳條件SPIO同時作為基因載體和MR示蹤劑的可行性和條件MR對體外標記細胞群成像東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11技術路線一、SPIO的合成——Fe2O3-PLL－制備氧化鐵納米粒子－與陽離子聚合物多聚賴氨酸(PLL)偶聯二、重組質粒DNA的構建pcDNA3.1/myc－heNOS（目的基因）pcDNA3.1/myc－EGFP（報告基因）東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11技術路線東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11三、內皮祖細胞的體外誘導培養及擴增－新西蘭大白兔－心臟穿刺抽血－梯度密度離心法分離－EGM-2MV培養液誘導培養技術路線四、SPIO轉染報告基因－探討SPIO介導基因轉染EPC的最優條件方法：不同條件下SPIO介導pcDNA3.1-myc－EGFP轉染

EPC分組：SPIO與質粒DNA不同質量比：1：1、2：1、5

：1

、

10

：1不同孵育時間：6h、12h、18h對照組：Lipofectamine?2000轉染組、未轉染組東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11結果：熒光顯微鏡觀察，得出轉染效率及最優轉染條件東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11技術路線五、目的基因(eNOS)的轉染及檢測方法：根據之前確定的最優轉染條件，利用SPIO攜帶pcDNA3.1-myc－eNOS轉染EPC分組：轉染組、空載體組、未轉染組東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11檢測：1、細胞：轉染組、空載體組、未轉染組－活力檢測（MTT法）－凋亡檢測（Annexin

V/PI雙染色法）－細胞周期檢測（流式細胞術）東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-112、eNOS基因表達：轉染組、空載體組、未轉染組－RT-PCR檢測mRNA－Western

Blot檢測蛋白表達東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-113、細胞內SPIO的測定:－電鏡觀察及能譜分析－原子吸收光譜儀于不同時間點測細胞內Fe濃度并繪制時間－衰減曲線－普魯士藍染色顯示細胞內Fe顆粒，Simple－PCI圖像分析定量標記率東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-114、MR掃描:*－4.7T

MR波譜儀：弛豫率R1、R2、R2

值*－1.5T

MR機細胞懸液成像:T1WI、T2WI、T2

WI標記細胞：104~107級濃度，不同時段未標記細胞：掃描一次東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11新西蘭大白兔外周血取材，單個細胞懸液制備EPC分離純化（貼壁細胞培養）內皮及祖細胞特性及功能檢測；細胞周期、活力、增殖與凋亡、代謝等生物學特性和功能鑒別SPIO合成（Fe2O3-PLL）cDNA-eNOS質粒構建表征分析SPIO-eNOS，不同體系和條件下分析SPIO的DNA結合能力和保護能力不同體系和條件下以SPIO為載體，攜帶eNOS轉染EPC（EPC-eNOS-SPIO）RT-PCR檢測mRNA,WesternBlot檢測蛋白表達胞內鐵定量及隨時間的衰減變化，形態學觀察胞內鐵顆粒，計算標記率。eNOS檢測EPC形態與功能檢測內皮祖細胞功能、細胞周期、活力、增殖與凋亡、代謝檢測SPIO測定不同細胞濃度MR成像及弛豫率分析東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11課題特色與創新用氧化鐵納米粒子攜帶基因轉染細胞，并利用其超順磁性 進行MR成像，將納米技術同時引入分子影像學和細胞、基 因治療學領域，具有創新性和顯著的特色。國內外文獻尚 未見報道。本研究是eNOS基因體外轉染EPC的基礎研究，旨在為二者 聯合治療心血管疾病提供理論基礎，具有理論上的先進性 和實用性。東南大學臨床醫學院碩士研究生開題報告2007-04-11年度研究計劃：2007.3-2007.4完成各項藥物、試劑的購買和準備工作，設計詳細的實驗實施方案。2007.4-2007.10完成細胞實驗。2007.10-2008.6整理資料、發表