人造血干細胞擴增的研究進展

關鍵詞：干細胞人造血

progressonStudyofTechniquesforExpansionofHumanHematopoieticStemCells

造血干細胞移植可能使遺傳血液病、免疫缺陷病及惡性腫瘤等完全治愈，由于HSC移植存在以下不足而受限制：⑴為獲得足夠量移植用HSC，必須進行大規模的骨髓抽吸或餐周血分離；⑵獲得的HSC量有限；⑶HSC輸注后產生的成熟細胞的生物動力欠佳，移植后1-3周內并無直接治療療效。移植前HSC培養擴增，可解決這些難題。當前主要有兩種：⑴細胞因子支持下篩選CD34+細胞的體外擴增；⑵基質支持下的灌注培養。下面就HSC培養的發展、HSC擴增方法以及展望等作一綜述。

1早期HSC培養及啟示

1半固體培養體系1966年，Bradley等[1]介紹了一種新的半固體培養方法用以培養骨髓。此法利用膠體凝膠作支托，沒有細胞微環境，只能維持造血祖細胞在1-2周內形成細胞集落，不能支持HSC的生長或分化。即使沒法加入營養物、生長因子等，培養時間也只能延長到2-4周。由半固體培養體系的期限性可推斷，早期原始HSC不能在這樣的培養體系中存活、增殖。

2Dexter培養體系Dexter等于1977年建立了骨髓液體培養體系。此培養法基礎是建立一骨髓基質細胞支持層，形成二維空間結構，培養體系不單提供了營養、細胞因子，而且提供了類似于體內的細胞-細胞關系，使此法纖維造血8-12周。極限稀釋法技術證明，在Dexter培養體系中，前造血祖細胞在培養第一周前已開始減少。應用細胞免疫表型分析提示，該體系培養的骨髓CD34+、CD38-細胞不能更新復制。早期造血細胞體外培養擴增方法的研究啟示：HSC細胞可在體外培養，但兩種培養方法均沒有建立適合其體外造血的微環境。尋求建立，一個合適的人HSC培養體系是研究的關鍵。

2目前HSC的體外擴增方法

理想的SHC培養方法要求既能最大限度地擴增各階段的造血細胞，又能維持甚至擴增HSC。目前較為成功的人HSC體外擴增方法主要有兩種：⑴細胞因子支持十篩選CD34+細胞的體外擴增；⑵基質支持下的灌注培養。

細胞因子支持下篩選CD34+細胞培養

HSC的特性HSC沒有任何形態方面的特征，也沒有獨特的免疫表型迄今尚無直接檢測的方法。HSC只能通過脾結節形成法檢測，也可通過檢測高增殖潛能集落形成單位長期培養啟動細胞反映其存在。其免疫表型特征有：CD34+、Thy-1-/弱+、Lin-、CD33-、CD38-、CD45Ro-、HLA-DR-。其Rh-123熒光呈陰性或低強度，對4-HC/5-Fu有抗性。HSC是不均一的細胞群體，早期的造血細胞大部分處于G0/G1期，啟動慢，但擴增持續時間長，擴增倍數高，造血細胞產量高。較成熟造血細胞啟動快，短期擴增倍數高，維持時間短，產物多是成熟細胞，造血祖細胞產量少。

細胞因子的造血調節根據細胞因子對造血細胞不同的作用階段將其分為：⑴特異性細胞因子：大多作用于分化后期，包括EPo、TPo、M-CSF、G-CSF和IL-5；⑵無系特異性細胞因子：作用于分化狀態的HSC，包括IL-3、GM-CSF和IL-4，其功能主要維持處于G0期之外所有HSC的生存、增生；⑶G0期作用細胞因子：包括IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、G-CSF、LIF和SCF，維持早期HSC的存活或促其分化擴增：⑷抑制血細胞生成的細胞因子：包括TNF-α、TNF-βIFN和MIP-1α等，其中INF和TNF-Αfq系特異性，TGF-β主要抑制早期血細胞生成，MIP-α抑制原始的HSC的增殖。

擴增策略目前細胞因子支持下篩選CD34+細胞體外擴增方法研究最為普遍。實驗證明，篩選早期HSC剔除成熟的CD34-細胞進行擴增，可獲得更好的效果。單獨應用一個細胞因子擴增人HSC效果不佳，多個因子合理組合才能獲得理想的擴增效果。一般認為，生長因子合理組合應包括：⑴抑制細胞殘死亡的存活因子，如IL-1、IL-6和SCF等⑵刺激早期造血細胞增殖的因子，如SCF、IL-3和GM-CSF等；⑶定向擴增刺激因子，如G-CSF和EPO等。

Moore[10]用delta培養法培養骨髓CD34+細胞，發現未用因子時CFU-GM迅速消失；而單用SCF、IL-1、IL-3或IL-6等因子時，14天培養CFU-GM維持不變或只擴增2-8倍；用SCF/IL-3聯用另3個或3個以上因子組合擴增效果更好。多數人認為合適的細胞因子組合為IL-1/IL-3/IL-6/G-CSF/GM-CSF/SCF，14-17擴增經動員外周血CD34+細胞，使CFU-GM增殖66倍[11]，以擴增非MPBCD34+細胞，使CFU-GM增殖55倍[12]。而Bruggert等[13]則認為SCF/IL-1/IL-3/IL-6/EPD最適于外周血CD34+細胞擴增，12-14天培養，擴增CFU-GM250倍，CFU-Mix25倍。而擴增臍血CD34+、CD45RAlow、CD77low的CFU-GM和BFU-E的最好因子組合分別為SCF/IL-6/PIXY/M-CSF和SCF/IL-6/IL-3/EPO，擴增兩者的最佳組合是SCF/IL-6/PIXY/M-CSF/G-CSF/EPO[14]。NakahataT[15]指出，早期HSC大部分無IL-6R表達，IL-6/Sil-6R復合體激發HSC表達gp130，啟動HSC自我復制的信號傳遞，而c-Kit/SCF是HSC自我自制擴增的另一信號傳遞途徑。無血清條件下，IL-6/SIL-6/SCF孵育人臍血CD34+細胞，細胞總數和造血祖細胞數隨Sil-6R增加而明顯增加，培養14天，

CFU-GM擴增近70倍，集落中除了幾個CFU-M和BFU-E外，有大量的CFU-GEMM和CFU-Blast；有血清的情況下，培養7天，14天，分別擴增CFU-Mix60倍和70倍。由此說明，細胞因子促進造血是通過與期受體結合引起信號傳遞而起作用的，為體外造血研究開創了新的思路。

細胞因子支持下篩選CD34+細胞擴增法有以下優越性：⑴條件容易控制，產量穩定；⑵無異體基因污染。缺點是：目前還無可完全代替基質的細胞因子，單用因子不能維持體外長期造血；需不斷加入因子，費用昂貴，不能大規模使用。

基質細胞支持的灌注培養

此培養方法提供HSC一個接近于體內的造血環境，能擴增各階段的造血細胞，并維持甚至擴增原始HSC，稱原始HSC培養方法。

基質支持作用此作用除了通過細胞-細胞接觸的直接作用外，還分泌許多因子影響造血過程。骨髓基質是最常用的造血支持層來源，包括基質細胞、基質細胞分泌的胞外基質以及多種造血生長因子調節HSC的造血動力學。用作造血支持的基質細胞除骨髓外還包括其它許多來源的細胞。基質細胞與HSC可以同基因或異基因、同種或異種。此外，還建立了許多轉化的基質細胞系，用于造血支持。經過轉化的基質細胞系具有分泌細胞因子的功能，加強造血調控。Otsukat等[16]報道，在長期培養體系中，以基因工程改造的成纖維細胞為支持細胞，使之分泌GM-CSF、G-CSF和IL-3因子，相同濃度下，這些因子對HSC增殖有更強的刺激作用。

直接比較基質支持培養和細胞因子支持培養的擴增效果顯示，目前可能用到的任何細胞因子都無法完全代替基質細胞的支持作用。因子培養結果，原始HSC常常減少，而只有基質支持的培養可使原始HSC維持不減甚至擴增[17，18]。有實驗顯示，骨髓的LTC-IC在細胞因子支持下培養只維持35%的啟始量，而基質細胞卻能令其擴增5倍[16]。臍血LTC-IC在因子作用下培養7天，擴增2-7倍，培養14天，擴增2-3倍，而基質細胞卻可達加倍的擴增效果[19]。用微孔網把HSC和基質隔開稱基質非接觸共培養，近期文獻認為，HSC與基質接觸與否并不影響增殖分化[20]。相反，非接觸可部分地使HSC與產生增殖負性細胞因子信號的隔開，減輕造血受抑。

造血生長因子支持作用。基質支持灌注培養常加用因子，以加強HSC的擴增效果。因子一方面支持基質細胞，起間接造血作用，一方面直接刺激HSC存活、增殖、分化。Koller等[18]在生物反應系統中，加入IL-3/IL-6/SCF培養臍血單個核細胞，15天培養擴增CFU-GM11倍、5天倍、3天倍及5天LTC-IC3個樣品中2個擴增3倍。他的另一實驗，基質細胞支持培養不同純度的人骨髓CD34+細胞，采用多種因子組合比較，以IL-3/IL-6/SCF/EPO及IL-3/GM-CSF/SCF/EPO擴增效果最佳，細胞、祖細胞數明顯增加，而且維持LTC-IC不減[17]。

介質灌注作用介質灌注是影響HSC培養的又一重要因素。介質灌注可以保證營養、細胞因子等供應，清除有造血抑制代謝產生，刺激基質細胞分泌因子[21]。控制適當的介質灌注，顯著地提高體外造血的效率。已知，體內組織細胞細胞密度為5×108·ml-1的漿灌注為·kg-1·min-1，相當于細胞密度為106·ml-1，含20%血清的培養介質，每天全部更換一次。Schwartz等[22]按7V·W-1，·W-1和1V·W-1換液培養低密度的骨髓MNC，發現·W-1換液效果最好，可維持造血20周。整個過程，細胞產量傳統Dexter培養法的3倍，而且維持祖細胞穩定生產直到18周，在已報道文獻中，造血維持時間最長。Plasson等也發現同樣結果。

氧濃度的影響Koller等認為5%低氧化正常20%氧濃度更能刺激造血，實驗見CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM分別擴增12倍、3倍和4倍。此外，延長祖細胞維持時間1-2周。而Palson等的實驗則顯示20%o2最利于體外造血，40%O2次之，5%及60%O2最差。

生物反應器作用有人通過改進反應器提高HSC擴增效果。如Davis等[26]利用人造血毛細血管系統用豬內皮細胞支持培養骨髓CD34+細胞、培養18天，CD34+細胞擴增150倍、CFU-GM1600倍、CFU-Blast77倍，效果特點顯著。應用該體系，造血祖細胞及早期造血細胞均獲相當高的擴增，似乎找到HSC擴增的真諦。

培養啟始HSC純度影響低純化或不純化MNC灌注培養具有以下優點：⑴保存盡量多的CD34+輔助細胞；⑵大量的基質細胞在培養過程中可形成支持層；⑶減少篩選過程對HSC破壞。Koller等用不同純度的CD34+LIN-細胞灌注培養，證明CD34+LIN-細胞純度越低，擴增細胞、CFU-GM和LTC-IC倍數越高，而以后兩種最受影響。

其它細胞接種密度和收獲時機對HSC擴增效果有一定影響。粘附因子介導HSC和基質細胞的接觸刺激HSC增殖分化，也是不可忽視的因素。

基質細胞支持下灌注培養有如下優點：⑴維持造血時間長達數月；⑵可維持LTC-IC不減甚至擴增；⑶細胞因子應用少，費用低；⑷擴增前無太多的處理，保持HSC的活性，避免去除輔助細胞。缺點是條件不易控制，產物不穩定。

3展望

由于目前對HSC的特性尚未透徹了解，所以HSC體外擴增要獲得不同階段的細胞大量增殖，同時擴增原始細胞量遇到困難。以后研究可以主要集中于以下幾個方面。

HSC增殖分化的調控基因研究在分子水平和基因水平把握造血的的機制，指導體外HSC的培養，HSC逐漸分化，喪失自我更新的能力，可有由于基因易位和重排所致。若然如此，通過基因重新復位，可使一個已經分化的細胞返祖為HSC。在此領域研究信號傳導機制，可以在關鍵點阻斷HSC分化信號傳導，而加強自我更新信號傳導，提高HSC的擴增。

新的造血生長因子的發現，目前所用的造血生長因子均無法代替基質細胞的作用，說明仍存在某種未知的關鍵造血調控因子。致力于新的造血生長因子發現，將對改善HSC培養起巨大作用。

定向細胞培養使HSC向某一系定向增殖是HSC培養的新方向。針對臨床不同需要，選擇性擴增紅細胞、粒細胞、淋巴細胞、血小板、NK細胞等具有廣闊的應用前景。

可以相信，隨著細胞生物學，分子生物學及其相關學科和技術的發展，對HSC了解會更加明了，HSC的擴增會逐步完善。HSC擴增技術的發展將為血液系統疾病、腫瘤的基礎研究和臨床治療提供充足的材料和新的技術方法。

參考文獻

BradleyTR,etgrowthofmousemarrowcellsinJExpBiolMedSci,1966:44:287

DexterTM,etcontrollingtheproliferationofhaemopoieticstemcellsinvitroJCellsPysiol,1977;91:335

GartnerS,ettermcultureofhumanbonemarrowNatlAcadSicUSA,1980;77:4656.

SutherlandHJ,etmechanismswithandwithoutsteelfactorsupportprimitivehumanhematopoiesis,Blood,1993;81:1465

LansdorpPM,etchange:inproliferativepotentialofhumanhematopoieticExpMed,1993;178:787

MetcalfD,Hematopoieticregulator:redundancyorsubtlety?Blood,1993:82:3515

HeimfiedS,etvivoexpansionanalysisfromCD34+HLA-BRI,CD34±andCD38+subestEepHematol,1994(Abstr):22:756

BjomsonofCFU-NMandCFU-Eosbymatruregranulocytes,Blood,1984:63:376

TavassoliM,HematopoeticsurvivalHematol,1993;21:1411

MooreMA,ExpansionofmyeloidstemcellsinHematol,199:32:183

HaylockND,etvivoecpansionandmaturationofperipheralbloodCD34+cellsintothemyeloidlineage,Blood,1992;80:4405

SatoNetexpansionofhumanperipheralbloodCD34+cells,Blood,1993;82:3600

BruggerW,etvivoecpansionofenrichedperpheralbloodCD34+progenitorcellsbystemcellfactor,interleukin-1beta(IL-1beta),IL-6,IL-1,interferon-gamma,anderythropoietinBlood,1993:81:2579

MayaniH,etselectiverexpansionandmaturationoferythroidversusmyeloidcordbloodprecurrsor,1993;81:3252

NakahataT,Expansionofhematopoietic:BajusJL,et,EducationProgramofThe26thCongressofTheIntemationalSocietyofHaematologySingapore,1996;29-302

OsykaTeteffectsofinterleukin-6andinterleukin-3onearlyhematopoieticeventsinlong-termculturesofhumanmarrow,ExpHematol,1991;19:1042

KollerMR,etcultureinitiatingcellexpansionisdependentonfrequentmediumexchangecombinedwithstromalandotheraccessorycelleffects.Blood,1995;86:1784

KollerMR,etofprimitaivehumanhematopoieticprogenitorsinaperfusionbioreactorsyystemwithIL-3,IL-6andstemcell,1993;11:358

HanCS,etvitroexpansionofumbilcalcordbloodcommittedandprimitiveHematol,1994(Astl):22:723

VerfaillieCM,Directcontactbetweenhumanprimitivehematopoieitcprogenitorsandbonemarrowstuomaisnotrequiedforlong-terminvitrohematopoiesis,Blood,1992;79:2821

GubaS