實驗四酸性磷酸酶及值測定第1頁，課件共19頁，創作于2023年2月酸性磷酸酶：

催化磷酸單酯的水解反應存在于人的肝臟，前列腺等處植物中以發芽的種子中含量最為豐富。

是生物體中重要的一種酶類，為某些疾病的檢測指標。一、概述第2頁，課件共19頁，創作于2023年2月酶液磷酸苯二鈉苯酚＋磷酸氫二鈉

folin-酚測定酚的濃度

計算出反應速度（用產物生成量/min來表示）

根據雙倒數法計算出Km及Vmax二、實驗原理第3頁，課件共19頁，創作于2023年2月第4頁，課件共19頁，創作于2023年2月

V=Vmax[S][S]Km+第5頁，課件共19頁，創作于2023年2月三、實驗步驟：1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2、制作酶反應時間與產物生成量的關系曲線3、制作酚標準曲線4、[S]與V0關系實驗

5、雙倒數作圖法計算Vmax和Km

第6頁，課件共19頁，創作于2023年2月buffersubstrateenzymeCertainTimeblankStopthereactionColordeveloped第7頁，課件共19頁，創作于2023年2月生化實驗課老師：于曉虹實驗報告請交到講臺上來酶液稀釋取上清液３００微升，稀釋３０倍，用大試管裝科代表李博恒第8頁，課件共19頁，創作于2023年2月

1、磷酸酶原液的制備：稱取5g綠豆芽莖（去頭去根），加入pH5.6的HAC緩沖液2ml研磨成漿并靜置30分鐘。紗布過濾，取1.8ml濾液,以6000rpm，離心20min，取上清。上清液用pH5.6的HAC緩沖液稀釋30倍，用于實驗。第9頁，課件共19頁，創作于2023年2月2、制作酶反應時間與產物生成量的關系曲線（目的：選取合適的反應時間）第10頁，課件共19頁，創作于2023年2月加液程序表管號1234560磷酸苯二鈉0.50.50.50.50.50.50.5酶液0.50.50.50.50.50.5精確反應時間3510152025碳酸鈉溶液2222222酶液－－－－－－0.5Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5

Folin－酚溶液已稀釋好！注：進行酶促反應時，注意預熱，使所有的反應在同等條件下開始35℃保溫10分鐘第11頁，課件共19頁，創作于2023年2月0123456反應時間03510152025吸光度結果：以反應時間為橫坐標，A680nm為縱坐標，繪制反應進程曲線，并從該曲線上求出酸性磷酸酶反應初速率的時間范圍。第12頁，課件共19頁，創作于2023年2月3、制作酚標準曲線（目的：可從酚標準曲線上查出A680nm所相當的酚含量,并計算出反應速度（用每分鐘產物生成量來表示）第13頁，課件共19頁，創作于2023年2月0123456780.4mMphenol

standardsolution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21MNa2CO3222222222Folin-phenolreagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加液程序表35℃保溫10分鐘第14頁，課件共19頁，創作于2023年2月012345678酚含量/μmol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度結果：以酚含量（μmol）為橫坐標，A680nm為縱坐標，繪制標準曲線。以0號管作空白，在可見光分光光度計680nm波長處讀取各管的吸光度（A680nm）。第15頁，課件共19頁，創作于2023年2月4、[S]與V0關系實驗第16頁，課件共19頁，創作于2023年2月實驗加液程序表管號1234560磷酸苯二鈉0.100.150.200.250.300.500.50醋酸緩沖液0.400.350.300.250.20--酶液0.500.500.500.500.500.50-

精確反應15分鐘35度碳酸鈉溶液2222222Folin－酚溶液0.50.50.50.50.50.50.5酶液－－－－－－0.5

35℃保溫10分鐘測680nm處吸光度

注：進行酶促反應時，注意預熱，使所有的反應在同等條件下開始第17頁，課件共19頁，創作于2023年2月實驗中需注意事項：酶反應作用時間精確控制

第18頁，課件共19頁，創作于2023年2月Tubenumber123456[S](mM)0.50.7511.251.52.51/