單次靜滴法舒地爾及其活性代謝物羥基法舒地爾在健康人體的藥動學研究

氨基熱耦合是一種主要的抗凝劑，其主要激酶抑制劑。Rho激酶磷酸化肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的肌球蛋白結(jié)合亞基,抑制磷酸酶活性(該磷酸酶的作用是將磷酸化肌球蛋白脫磷酸,使肌肉松弛);還能直接磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC),從而收縮平滑肌,導致血管痙攣。法舒地爾在正常或病理情況下都能競爭性結(jié)合Rho激酶催化區(qū)的ATP位點,阻斷Rho激酶的活性。它能強效擴血管、保護缺血腦組織,目前臨床主要用于蛛網(wǎng)膜下腔出血手術(shù)后腦血管痙攣、腦缺血等的防治。其羥化活性代謝產(chǎn)物羥基法舒地爾特異性更高,在體內(nèi)保留時間更長,與法舒地爾共同發(fā)揮藥理作用。由于Rho蛋白/Rho激酶系統(tǒng)在細胞分子水平生命活動中有著重要意義,近年來,對法舒地爾的相關研究不斷深入,證明其具有腦、心血管系統(tǒng)的保護作用1995年6月,鹽酸法舒地爾(商品名:依立盧)由日本旭化成株式會社上市,目前在日本得到了廣泛應用。已進口至中國。鹽酸法舒地爾中堿基部分發(fā)揮藥效,其化學結(jié)構(gòu)為六氫-1-(5-硫磺基異喹啉)-1(H)-1,4-二氮雜鹽酸法舒地爾和甲磺酸法舒地爾在中國人體內(nèi)的藥動學研究均未見報道。本試驗研究并比較了這兩種藥在中國健康受試者體內(nèi)的藥動學特點。1材料表面1.1法舒地爾藥品試驗藥物:注射用甲磺酸法舒地爾(武漢啟瑞藥業(yè)有限公司,每支西林瓶含本品35mg,相當于法舒地爾25mg,有效期至2010年1月);對照藥物:鹽酸法舒地爾注射液(商品名:依立盧)(旭化成制藥株式會社名古屋醫(yī)藥工廠,2mL:30mg,相當于法舒地爾27.3mg。批號ERS11MM);甲磺酸法舒地爾對照品(武漢啟瑞科技發(fā)展有限公司,批號071201,純度99.7%);鹽酸羥基法舒地爾對照品(美國Sigma公司,純度98.3%);雷尼替丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號100163-200405,純度>99%;甲醇與甲酸為HPLC級;甲酸銨為分析純;蒸餾水(WaterProPS型超純水機制備);人空白血漿(北京安貞醫(yī)院血庫)。1.2電噴霧離子束的表征Agilent1100液相色譜系統(tǒng)(美國Agilent公司,包括G1311A型四元輸液泵,G1313A自動進樣器,G1316A型柱溫箱和G1322A型脫氣機);3200QTrap串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀[美國AppliedBiosystems公司,電噴霧離子源(ESI)];Analyst1.4.2數(shù)據(jù)采集軟件(美國AppliedBiosystems公司)。CP225D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);TGL-16C型高速離心機(上海安亭科學儀器廠);WaterProPS型超純水機(美國Labconco公司);BF-2000A型氮氣吹干儀(北京八方世紀有限公司)。2對象和方法2.1同意書的篩選試驗方案經(jīng)北京安貞醫(yī)院倫理委員會批準通過。健康志愿者簽署書面知情同意書后參加篩選。入選12例中國健康受試者,男女各半,年齡為(33±4)歲,身高為(163±7)cm,體重為(59±8)kg,體重指數(shù)(BMI)在19.2~24.0kg·m2.2分組及清洗時間雙周期兩制劑交叉試驗設計。12名受試者,男女分別隨機,分為兩組,每組3男3女。第一組第一周期單次靜滴甲磺酸法舒地爾35mg,第二周期靜滴鹽酸法舒地爾30mg,中間經(jīng)過3天清洗期。第二組反之。2.3舒地爾一支的稀釋藥物配制方法:甲磺酸法舒地爾一瓶(35mg)溶于100mL生理鹽水;鹽酸法舒地爾一支(30mg)用100mL生理鹽水稀釋。給藥方法:受試者進食統(tǒng)一清淡早餐后,經(jīng)靜脈滴注用輸液泵(四道輸液泵GeminiPC-4)輸注已配藥物輸液,輸液泵速度200mL·h2.4靜脈血給藥于給藥前采集空白血,于給藥后10,20,30,35,40,45,60,75,90min,2,4,6,8,12h經(jīng)前臂靜脈套管針取靜脈血3mL(每位受試者15個血樣)。給藥過程中10,20min時左臂給藥,右臂采血。給藥30min時左臂停藥,右臂同時采血。血樣置肝素化采血管中,3000r·min留取6份尿樣,收集尿液間隔為:0時尿(給藥前),0~2,2~4,4~8,8~12,12~24h。準確量取并記錄給藥后各時間段尿液體積,尿樣冷凍于-80℃冰箱保存,待測。2.5生物樣品處理方法在生物樣品處理中,內(nèi)標為雷尼替丁,質(zhì)量濃度為10μg·L2.5.1流動相復溶精密取出200μL血漿樣本,加入100μL內(nèi)標溶液,再加入500μL甲醇,漩渦振蕩、離心,取出600μL上清液至10mL離心管,40℃水浴氮氣吹干,用100μL流動相復溶,離心,20μL上清液進樣。2.5.2樣品處理精密取出200μL尿液樣本,加入100μL內(nèi)標溶液,漩渦振蕩30s,30μL上清液進樣。2.6法舒地爾、羥基法舒地爾和內(nèi)標的保留時間及穩(wěn)定性經(jīng)過5個分析批的方法學考察,確證了該方法的特異性、靈敏度、精密度等,無基質(zhì)效應。以藥物和內(nèi)標的色譜峰面積比值對藥物濃度進行加權(quán)線性回歸,表明血漿中法舒地爾和羥基法舒地爾的線性范圍均為0.4~400μg·L方法學考察期間法舒地爾、羥基法舒地爾和內(nèi)標的保留時間分別為(3.40±0.01)、(3.27±0.01)和(2.73±0.04)min,RSD/%分別為0.16,0.16和1.53。血漿和尿液樣品室溫放置,反復凍融及長期穩(wěn)定性均符合規(guī)定。本方法重現(xiàn)性好,測定時間短(5min/樣品),適用于法舒地爾的人體藥動學研究。2.7質(zhì)譜掃描參數(shù)dp色譜條件:色譜柱:ZORBAXStableBond-C質(zhì)譜條件:儀器:AB3200QTrap,電噴霧電離源(ESI),正離子模式。掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM),法舒地爾、羥基法舒地爾和雷尼替丁MRM掃描的離子對分別是m/z292.2※99.2,m/z308.2※99.2和m/z315.3※176.2。離子源參數(shù):CUR=172.375Kpa,IS=5500V,TEM=750℃,GS1=344.75kPa,GS2=482.65Kpa。優(yōu)化后法舒地爾和羥基法舒地爾的MRM質(zhì)譜掃描參數(shù)DP,EP,CE分別是60V,7V,40V;內(nèi)標的MRM質(zhì)譜掃描參數(shù)DP,EP,CE分別是40V,4V,20V。2.8處理數(shù)據(jù)血藥濃度數(shù)據(jù)采用皖南醫(yī)學院孫瑞元教授主編的DAS2.1.1軟件擬合,確定其藥動學模型和權(quán)重,計算各藥動學參數(shù)。其中,達峰時間t3結(jié)果3.1血漿內(nèi)源峰干擾分離空白血漿、空白血漿加入標準品及受試者給藥10min的血漿樣品色譜圖見圖1,從圖1中可知,法舒地爾、羥基法舒地爾與雷尼替丁內(nèi)標峰分離良好,不受血漿內(nèi)源峰干擾。3.2血藥濃度曲線12名健康受試者單次靜脈滴注甲磺酸法舒地爾和鹽酸法舒地爾的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。3.3權(quán)重的確定12名中國健康成年受試者分別單次靜滴甲磺酸法舒地爾和鹽酸法舒地爾,用DAS2.1.1軟件進行藥動學處理。血藥濃度-時間數(shù)據(jù)符合一室模型,權(quán)重采用1/cc。兩種藥物的藥動學參數(shù)見表1。兩種藥物的法舒地爾各藥動學參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單次靜滴甲磺酸法舒地爾后法舒地爾的藥動學參數(shù)(ρ兩種藥的羥基法舒地爾各藥動學參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但受試者個體間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。單次靜滴甲磺酸法舒地爾后羥基法舒地爾的t本試驗法舒地爾24h尿回收率為5.43%。羥基法舒地爾24h尿回收率為35.4%。3.4安全評估試驗過程中有1例AST輕度升高(53u·L4人體藥動學參數(shù)法舒地爾半衰期較短,僅為約20min,因此洗脫期設為3d。本試驗中的試驗藥物甲磺酸法舒地爾相當于法舒地爾25mg,對照藥物鹽酸法舒地爾相當于法舒地爾27.3mg。單次靜滴甲磺酸法舒地爾和鹽酸法舒地爾后法舒地爾的ρ有文獻報道法舒地爾給藥后血液中立即代謝產(chǎn)生羥基法舒地爾,同時法舒地爾迅速衰減。羥基法舒地爾消除緩慢,AUC值比法舒地爾高數(shù)倍。法舒地爾半衰期為0.25~0.78h;羥基法舒地爾為1.67~4.66h。本試驗中單次靜滴甲磺酸法舒地爾35mg后法舒地爾和羥基法舒地爾