江蘇省雜草稻rc基因序列測定及分析

水稻通常是世界上廣泛分布的。亞洲、非洲、南美洲和大西洋等50多個(gè)國家都有關(guān)于雜草水稻的報(bào)告。雜草稻具有較強(qiáng)的生物競爭性,與栽培稻競爭光、水分和營養(yǎng)雜草稻的紅色果皮是區(qū)別于普通栽培稻的一個(gè)重要特征Rc基因是水稻果皮原花色素積累途徑中最重要的調(diào)節(jié)基因之一,位于第7染色體上,全長約6.4kb,包含有8個(gè)外顯子,產(chǎn)物為一個(gè)具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)元件的調(diào)節(jié)蛋白為了說明江蘇省雜草稻紅色果皮基因的變異類型及探討其來源,在對江蘇省雜草稻進(jìn)行全面調(diào)查的基礎(chǔ)上1材料和方法1.1江蘇省雜草稻1份序列分析樣品總計(jì)179份,其中我們新測定了13份樣品,其余166份樣品來源于NCBI和現(xiàn)有文獻(xiàn)。新測定的樣品包括來自南通如皋(WRL-1047)、江都(WRL-1334)、常州(WRL-2537)、連云港贛榆(WRL-3446)、徐州邳州(WRL-3478)、鹽城建湖(WRL-3710)、淮安(WRL-3738)、泰州興化(WRL-3779)、南京江寧(WRL-4658)和蘇州(WRL-4781)的雜草稻各1份,以及江蘇粳型栽培稻(WRL-163)1份,連云港穞稻(WRL-162)1份,安徽塘稻(WRL-1430)1份。其中,江蘇連云港穞稻和安徽塘稻至少自生了上百年,自古被認(rèn)為是雜草稻樣品包括66份雜草稻(O.spontanea)[(56份美國南部雜草稻(25°50′N-40°35′N),10份中國江蘇雜草稻(30°45′N-35°32′N),1份江蘇省連云港穞稻(Ludao),1份安徽省塘稻(Tangdao),1份PerlaRosso,70份栽培稻(O.sativaL.)(來自美國、中國、日本、印度、孟加拉國等)以及24份普通野生稻(O.rufipogonGriff.)與3份一年生野生稻(O.nivaraSharmaetShastay);另外,還包括2份展穎野生稻(O.glumaepatulaSteud.),2份南方野生稻(O.meridionalisNg.),7份非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)和2份巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)(序列信息見在線輔助性表S2,/CN/article/showSupportInfo.do?id=2442)。1.2獨(dú)立設(shè)計(jì)、pcr擴(kuò)增和序列測量單株種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦農(nóng)場,于分蘗期收取單株葉片,以SDS法提取DNA1.3處理數(shù)據(jù)測序片段的拼接和序列比對采用VectorNTI8.02結(jié)果與分析2.1日本雪rc基因第735.所有材料利用脫殼機(jī)脫去種子外殼,查看穎果果皮顏色(圖1-A),其中普通野生稻、穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)以及10份江蘇省雜草稻是紅色果皮;日本晴與江蘇粳型栽培稻(WRL-163)為白色果皮。這排除了江蘇省雜草稻以及穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)為rc、Rc-s、rc-g1等位基因型的可能性。采用Primer5.0軟件針對日本晴Rc基因第7外顯子缺失14bp的部位,設(shè)計(jì)了PCR引物RED4,其中,RED4-For:5′-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3′,RED4-Rev:5′-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3′。紅色果皮RED4PCR理論產(chǎn)物為118bp,白色果皮RED4PCR理論產(chǎn)物為104bp。RED4對稻種樣品單株DNA擴(kuò)增片段PAGE膠電泳結(jié)果顯示(圖1-B),穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)及10份江蘇雜草稻、普通野生稻的PCR產(chǎn)物帶型一致,片段大小與預(yù)期的118bp一致。而日本晴對照材料以及江蘇水稻材料均缺失14bp,大小與預(yù)期的104bp一致,說明江蘇穞稻和雜草稻的紅色果皮基因均不存在14bp的缺失,排除了rc為了檢測是否還存在其他等位基因,對穞稻、塘稻、10個(gè)江蘇雜草稻樣品、江蘇省粳型栽培稻進(jìn)行Rc全基因測序,并與目前發(fā)現(xiàn)的6種Rc等位基因進(jìn)行共線性分析,結(jié)果顯示本次測定的江蘇10雜草稻樣本與穞稻和塘稻均為Rc野生型(圖2)。2.2rc基因及進(jìn)程在179份樣品中,去除展穎野生稻(O.gluma-epatulaSteud.)2份、南方野生稻(O.meridionalisNg.)2份、非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)7份、巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)2份、穞稻和塘稻各1份。將164份樣品分為野生稻(n=27)、栽培稻(n=71)、雜草稻(n=66);栽培稻中的粳稻(n=43)和秈稻(n=28);雜草稻中美國雜草稻(n=56)和中國江蘇省雜草稻(n=10),進(jìn)行了Rc基因(6.4kb)核苷酸多樣性分析(表1)。結(jié)果顯示,普通野生稻Rc基因的核苷酸多樣性均高于栽培稻和雜草稻,而栽培稻Rc基因的核苷酸多樣性高于雜草稻,其中秈稻Rc基因的核苷酸多樣性高于雜草稻,粳稻則低于雜草稻。江蘇雜草稻Rc基因的單倍型數(shù)目(h=3)與美國雜草稻(h=3)相同,但分離位點(diǎn)數(shù)(S=5)大于美國雜草稻(S=2);每千個(gè)堿基中核苷酸多樣性(π=0.19)高于美國雜草稻(π=0.09);同時(shí)分離位點(diǎn)比例(θ從Tajima’sD值來看,僅野生稻和栽培粳稻達(dá)到了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平,其中栽培粳稻的數(shù)據(jù)極偏離零(P<0.001);而江蘇和美國雜草稻的Tajima’sD值(-1.38818和1.41313)均未達(dá)到顯著水平,符合中性進(jìn)化定律。同時(shí)進(jìn)一步分析了上述164份樣品共同計(jì)算結(jié)果的高頻率單倍型(n≥2)序列差異(圖3)。發(fā)現(xiàn)普通野生稻高頻單倍型最多,僅27個(gè)樣品就具有5種高頻率單倍型;栽培稻其次,71個(gè)樣品共分離出3種高頻率單倍型,并且H1高頻率單倍型占有了75.7%的栽培稻樣品;而雜草稻高頻率單倍型最少,66個(gè)樣品只分離出2種高頻率單倍型,其中H14高頻率單倍型為雜草稻所特有。2.3水稻各品種c、n、p-qp基因的進(jìn)化樹及基因組織特點(diǎn)在179份樣品中,除去2份展穎野生稻(O.glumaepatulaSteud.)和2份南方野生稻(O.me-ridionalisNg.),保留175份樣品,應(yīng)用Network軟件基于最大簡約法(maximumparsimonymethod,MP法)來構(gòu)建Rc基因的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖,以進(jìn)一步說明江蘇省雜草稻Rc基因的來源(圖4)。A類群中主要包括普通野生稻和雜草稻,B類群中主要包括栽培稻、穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430)。其中白色果皮栽培稻(攜帶rc型馴化基因樣品)共8種單倍型,以H7(n=59)為主要單倍型[(該單倍型中還包括了4個(gè)普通野生稻、1個(gè)紅色果皮栽培粳稻、1個(gè)PerlaRosso(Rc進(jìn)一步采用全部179份稻種樣品,以貝葉斯法和最大似然法兩種計(jì)算方法,分別構(gòu)建6.4kbRc全長基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。兩種方法得到的進(jìn)化樹基本一致,不同點(diǎn)僅在于2份展穎野生稻(O.gluma-epatulaSteud.)、7份非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)和2份巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)間排列位置的微小差異(圖5)。圖中rc馴化等位基因與紅色果皮粳稻地方品種聚為一類,這其中包括穞稻(WRL-162)和塘稻(WRL-1430);Rc-s馴化等位基因則與紅色果皮的Aus種及秈稻地方品種更為接近;而江蘇省雜草稻與美國雜草稻聚為一類,與之鄰近的是普通野生稻、AUS種、香稻以及紅色果皮栽培稻。3討論3.1雜草稻紅稻類型紅色果皮是雜草稻(weedyrice)的重要鑒別特征之一,所以雜草稻又被稱為紅稻(redrice)。同時(shí),也是其產(chǎn)生危害的重要因素,如導(dǎo)致栽培稻品質(zhì)及價(jià)格顯著降低3.2江蘇省雜草稻rc基因的核苷酸多樣性和單倍型分析以往的研究表明,同一區(qū)域的雜草稻遺傳多樣性低本研究同時(shí)分析了164份樣品的高頻率單倍型(圖4),雖然雜草稻與栽培稻具有很高的遺傳相似性此外,江蘇10份雜草稻Rc基因的核苷酸多態(tài)性(π=0.19)和分離位點(diǎn)比率(θ3.3基因的貝葉斯進(jìn)化樹與江蘇省雜草稻的聚類分析關(guān)于江蘇省雜草稻的紅色果皮基因來源,目前的研究主要有三種假設(shè)進(jìn)一步構(gòu)建了179份樣品Rc基因的貝葉斯進(jìn)化樹與最大似然(ML)樹(圖5)。結(jié)果兩種計(jì)算方法得出的聚類圖表明,在系統(tǒng)樹中與江蘇省雜草稻臨近的是普通野生稻、AUS種、香稻以及紅色果皮栽培稻。這與Rc基因單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果相似(圖4),同時(shí),也與美國雜草稻的研究結(jié)果類似。Gross等3.4江蘇正發(fā)生的雜草稻與稻、塘稻的rc基因親緣關(guān)系江蘇省雜草稻危害的報(bào)道較早出現(xiàn)于21世紀(jì)初本研究通過構(gòu)建來自全球175份稻種Rc6.4kb全長基因的單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)(圖4),證明穞稻和塘稻雖與江蘇