火炬松ssr-pcr反應(yīng)體系優(yōu)化

經(jīng)過廣泛的引進和栽培，火炬松（ustaeda）產(chǎn)于美國東南部，生長迅速，樹干形狀筆直而完美，木材質(zhì)量好，松脂產(chǎn)量高，適應(yīng)性強。它在世界上許多國家和地區(qū)都被廣泛引入和種植，成為重要的速生建筑和紙漿材料樹種。我國于上世紀(jì)30年代引種火炬松,現(xiàn)已成為33°N以南、海拔500m以下亞熱帶低山、丘陵、崗地重要的用材林和原料林樹種,是我國引種的國外松中表現(xiàn)較好的一個樹種。目前,國內(nèi)對火炬松的研究集中在遺傳變異研究SSR標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性高、共顯性等特點,是開展分子標(biāo)記輔助育種和研究群體遺傳多樣性的有力工具。本研究擬采用單因素試驗及正交試驗設(shè)計建立火炬松SSR-PCR擴增反應(yīng)的優(yōu)化體系,以便下一步開展火炬松SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究。1材料和方法1.1松第1代樹種試驗材料采自湖南省汩羅縣白水苗圃火炬松第1代種子園半同胞家系苗木。野外采集的幼嫩針葉裝入盛有硅膠的自封袋中,干燥之后置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2試劑和提取物SSR-PCR擴增反應(yīng)所用試劑均采購于天根生化科技有限公司。SSR引物來自Auckland等1.3測試方法1.3.1提取和檢測各組dna選取火炬松健康幼葉、采用改良的CTAB法1.3.2sr-pcr擴增SSR-PCR反應(yīng)體系和擴增程序參考文獻1.3.3試驗設(shè)計根據(jù)基礎(chǔ)反應(yīng)體系,改變其中一個因素,其余因素保持不變,設(shè)計5因素5水平單因素試驗。DNA模板、引物、dNTPs、Mg1.3.4加熱溫度在優(yōu)化反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上,根據(jù)引物的解鏈溫度(Tm)設(shè)置6個水平的退火溫度梯度,每個梯度降低1℃,確定引物的最佳退火溫度。1.3.5pcr產(chǎn)物檢測PCR反應(yīng)擴增的產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,150V恒壓、50mA電流,時間5~10h,銀染法染色,拍照保存。1.3.6最合適反應(yīng)系統(tǒng)的評估和引用用優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系對火炬松樣本進行擴增,以驗證其穩(wěn)定性,并利用優(yōu)化體系從60對引物中篩選條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物對。2結(jié)果與分析2.1火炬松組的dna濃度和純度用EppendorfBiophotometer核酸蛋白分析儀測定提取的火炬松樣本DNA濃度與純度,其OD2.2單因素試驗2.2.1dna模板濃度在一定范圍內(nèi),DNA模板濃度越高,目的序列的擴增量越大,但如果模板濃度過高在電泳檢測時會出現(xiàn)條帶彌散的現(xiàn)象。不同DNA模板濃度對SSR-PCR擴增效果的影響如圖2所示。隨著DNA模板用量的增加,擴增產(chǎn)物也隨之增加,DNA模板用量為80ng和90ng時條帶清晰明亮。2.2.2引物濃度的影響引物濃度較低時擴增產(chǎn)物少,條帶較暗;濃度較高時促進非特異性擴增,有引物二聚體產(chǎn)生。不同引物濃度對SSR-PCR擴增效果的影響如圖2所示。由圖2可知,不同水平的引物濃度擴增效果差異不顯著,適當(dāng)增加各水平之間的濃度差擴增效果差異顯著,濃度為0.3μmol/L時條帶最好。2.2.3dnps濃度dNTPs是PCR反應(yīng)的底物,濃度過低直接影響擴增條帶的亮度;dNTPs分子中的磷酸基團可與Mg2.2.4MgMg2.2.5濃度對非特異性產(chǎn)品的影響Taq酶是PCR反應(yīng)的催化劑,濃度過低靶序列產(chǎn)量降低,濃度過高會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物增加。不同Taq酶濃度對SSR-PCR擴增效果的影響如圖2所示。當(dāng)Taq酶濃度為0.75U時條帶較好。2.3引物及dntps濃度根據(jù)單因素試驗結(jié)果,設(shè)定DNA模板用量為70~90ng,引物濃度為0.1~0.3μmol/L,dNTPs濃度為0.20~0.30mmol/L,Mg2.4道16退火溫度對26條帶的影響退火溫度對SSR-PCR擴增效果的影響如圖4所示。引物為PtTX3013,泳道1~6退火溫度依次為53、52、51、50、49、48℃。由圖4可知,6個溫度梯度均能擴增出清晰的條帶,隨著退火溫度的降低條帶亮度逐漸減弱,說明適當(dāng)?shù)靥岣咄嘶饻囟瓤稍黾訑U增產(chǎn)物。因此,引物PtTX3013的最適退火溫度確定為53℃。2.5pcr擴增結(jié)果利用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系對火炬松39個樣本進行SSR-PCR擴增,結(jié)果如圖5所示。所有樣本均能擴增出清晰明亮的條帶,說明所得反應(yīng)體系及程序擴增效果較好,結(jié)果穩(wěn)定可靠,可用于火炬松育種群體SSR標(biāo)記遺傳多樣性研究。3最佳反應(yīng)體系的確定SSR-PCR擴增反應(yīng)受DNA模板、引物、dNTPs、M