淋巴細胞分離與玫瑰花環形成實驗第1頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗目的熟悉淋巴細胞和外周血單個核細胞（PBMC）的分離方法學習E花環試驗的操作方法觀察顯微鏡下E花環的形態第2頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗原理淋巴細胞成功分離后，便于在體外對機體免疫細胞進行鑒定、計數或功能測定；還可以用于E花環試驗、淋巴細胞轉化試驗及淋巴細胞培養（需無菌操作）。淋巴細胞的方便來源是外周血，分離的原則是收率較高，純度較好，失活較低。無論采用哪種方法，應最大可能保持細胞應有活性。第3頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗原理分離的技術可根據細胞的物理性狀和表面標志設計，根據不同實驗目的可采用密度梯度離心法、吸附分離法和其它特殊分離法。第4頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗原理本實驗采用的是密度梯度離心法。該方法是根據各類血細胞比重的差異（外周血中各種細胞的密度不同，人紅細胞密度為1.093，粒細胞為1.092，淋巴細胞為1.074±0.001），利用比重介于某兩類細胞之間的細胞分離液對血液離心，使一定比重的血細胞依相應的密度梯度分布于不同的獨立帶，從而達到分離的目的。第5頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗原理人T淋巴細胞表面的CD2分子即綿羊紅細胞受體（ER），在一定的實驗條件下，可與綿羊紅細胞（SRBC）結合，形成玫瑰花結，稱為E玫瑰花環試驗(erythrocyte-roseetteformationtest)。該試驗常用于臨床檢測人外周血T淋巴細胞的數量和比例，由此可間接反映機體的細胞免疫功能狀況。第6頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗原理T細胞SRBCE受體（CD2)SRBC受體第7頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗器材注射器、刻度吸管、毛細吸管、玻片、試管、離心管肝素、無Ca、Mg的Hanks液、淋巴細胞分離液、雙蒸水、生理鹽水、0.8%戊二醛、瑞氏染液綿羊紅細胞懸液（雞紅細胞懸液）、離心機、水浴箱、顯微鏡等。第8頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗步驟1.取1ml豚鼠肝素抗凝血于試管中，加等量Hanks液稀釋，手動輕輕搖勻；2.取2ml淋巴細胞分離液加入15ml離心管中；3.用毛細吸管吸取抗凝血，將抗凝血全部沿管壁緩慢加入，注意保持兩種液體界面清晰4.室溫下立即置水平式離心機以2000rpm離心20分鐘，離心后分為4層。5.用毛細吸管仔細吸取血漿與分層液界面處單個核細胞（PBMC）層至一刻度離心管內。6.加入5倍以上體積的Hanks液洗滌3次，每次以2000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀主要為單個核細胞）。第9頁，課件共15頁，創作于2023年2月豚鼠背足靜脈取血一人抓住豚鼠，將其左或右后肢膝關節伸直；另一人消毒豚鼠的腳背面并找出背中足靜脈，以左手的拇指和食指拉住其趾端；右手持注射器刺入靜脈，徐徐抽取血液，達所需量時，拔出針頭，用無菌棉球壓迫止血。第10頁，課件共15頁，創作于2023年2月稀釋的血液分離液離心稀釋的血液分離液稀釋的血漿單個核細胞分層液粒細胞、紅細胞第11頁，課件共15頁，創作于2023年2月外周血單個核細胞（PBMC）主要指T、B淋巴細胞、NK細胞和單核細胞，是免疫學實驗中最常用的細胞群，PBMC的分離也是進行T細胞和B細胞分離純化的重要中間環節。第12頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗步驟5.取一定量的兔血于離心管中，用無Ca、Mg的Hanks液洗滌3次，每次離心1500rpm5min。將壓積RBC配制成1%紅細胞懸液。6.取0.1ml淋巴細胞懸液，加入等量1％RBC懸液和0.1ml小牛血清混勻，37℃水浴15min，500rpm離心5min，取出.（直接取樣，滴加事先滴有美蘭染液的載玻片上，計數早期RE花環）7.置于4℃冰箱20min，小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，輕輕轉動試管小心混勻。8.置于4℃冰箱15min，取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，鏡下觀察。

第13頁，課件共15頁，創作于2023年2月實驗結果計數花環個數，結合3個以上的SRBC為一個花環，計算活性E花環形成率，正常值為50%-80%。E花環形成率＝形成花結的淋巴細胞數/淋巴細胞總數

（形成花結+未形成