21、沒有人陪你走一輩子，所以你要適應孤獨，沒有人會幫你一輩子，所以你要奮斗一生。22、當眼淚流盡的時候，留下的應該是堅強。23、要改變命運，首先改變自己。24、勇氣很有理由被當作人類德性之首，因為這種德性保證了所有其余的德性。--溫斯頓．丘吉爾。25、梯子的梯階從來不是用來擱腳的，它只是讓人們的腳放上一段時間，以便讓別一只腳能夠再往上登。治療性疫苗治療性疫苗21、沒有人陪你走一輩子，所以你要適應孤獨，沒有人會幫你一輩子，所以你要奮斗一生。22、當眼淚流盡的時候，留下的應該是堅強。23、要改變命運，首先改變自己。24、勇氣很有理由被當作人類德性之首，因為這種德性保證了所有其余的德性。--溫斯頓．丘吉爾。25、梯子的梯階從來不是用來擱腳的，它只是讓人們的腳放上一段時間，以便讓別一只腳能夠再往上登。治療性疫苗第八章治療性疫苗（ChapterVIIICureVaccine）第一節概述（Outline）多數學者認為治療性疫苗應為發生疾病后為治療疾病所采用的疫苗，但對一些感染后免疫用的疫苗也可視為廣義的治療性疫苗。治療性疫苗的研制和應用已覆蓋了多種疾病。細菌方面，已有用麻風菌素治療麻風菌感染、用布氏桿菌素治療布魯菌感染、用滅活的自身菌苗治療金黃色葡萄球菌皮膚反復感染等。病毒方面則已開展了對人類免疫缺陷病毒（HIV），單純皰疹病毒（HSV），乙肝病毒（HBV）感染等的治療性疫苗的研制。此外還研制了針對自身免疫病和腫瘤的治療性疫苗。因此廣義治療性疫苗是指在已感染病原生物或患某些疾病的機體中，通過誘生機體的特異性或非特異性免疫應答，以達到治療或防止疾病惡化的生物制品。21、沒有人陪你走一輩子，所以你要適應孤獨，沒有人會幫你一輩1治療性疫苗課件2治療性疫苗課件3治療性疫苗課件4治療性疫苗課件52、基因重組技術的發展與應用

目前基因重組與表達技術已日趨成熟，不少微生物基因的表達產物已獲得，并可對其生物學特性進行研究，提供了用于發展治療性疫苗的組分。各種抗原成分的組合、拼接或用微生物抗原基因與不同細胞因子基因組成表達嵌合性蛋白，或使表達蛋白與藥物交聯的治療性疫苗為開發治療性疫苗提供了廣闊的前景。2、基因重組技術的發展與應用63、免疫學理論的發展

由于對HIV免疫的研究，大大推動了抗感染免疫的理論發展。對不同感染過程中體液與細胞免疫應答的詳細分析、抗原提呈、細胞內信號傳遞途徑的進一步了解、微生物對免疫細胞感染所造成的后果、以及裸DNA免疫的機制等均對發展治療性疫苗起了推動作用。3、免疫學理論的發展7二、治療性疫苗的特點（specialtyofcuringvaccine）治療性疫苗與預防性疫苗的根本不同點：1）對象不同：前者是已被感染或患病的機體，后者是健康的人群；2）目的不同：前者用于治療患者或防止疾病惡化，后者是用于預防；3）應用不同：前者須考慮患者的禁忌癥和適應癥，后者對未被感染的人群。研究注意以下特點：二、治療性疫苗的特點（specialtyofcuring81、免疫原的選擇與優化治療性疫苗所用免疫原的選擇需在深入研究治療對象的免疫應答基礎上選定。根據病原學的特點，一般選用的微生物抗原應為能引起中和性抗體及可誘生殺傷性T細胞（CTL）免疫應答的抗原；但還必須考慮患者的免疫應答，即患者已產生和未產生的免疫應答。為了更有效地刺激患者的免疫應答，有學者開展了嵌合免疫原或聯合免疫原型的疫苗。1、免疫原的選擇與優化92、動物模型的建立

為考核治療性疫苗的療效，需要建立模擬人體感染的動物模型。一種是在靈長類動物，如黑猩猩，猿猴中尋找相似的持續感染，如猴免疫缺陷病（SIV），或是在非靈長類動物中尋找類似感染，如類似人乙肝病毒的土撥鼠或鴨乙肝動物模型；或模擬人HSVⅡ，在雌性豚鼠中建立生殖道皰疹病毒感染等。另一種建立有病毒基因整合的轉基因動物，如用HBV基因建立的轉基因小鼠。2、動物模型的建立103、臨床應用的重要性

治療性疫苗和預防性疫苗的很重要區別是前者需要臨床醫生的積極參與（禁忌癥與適應癥）。由于治療性疫苗的對象是患者，因此常伴有免疫低或其他病理變化，在使用疫苗時需較預防性疫苗更為慎重。選擇對象時應有嚴格標準，對每種疫苗的療效也應用不同的評價標準。在免疫應答出現時還可能伴有免疫損傷而出現不良反應，需要醫生協同進行判斷。3、臨床應用的重要性11

第二節治療性疫苗的種類（categoryofcuringvaccine）1、根據治療性疫苗針對疾病種類的不同可分為：①細菌型治療性疫苗；②病毒型治療性疫苗；③腫瘤治療性疫苗；④自身免疫病治療性疫苗。2、根據治療性疫苗的作用機制可分為：①特異性治療性疫苗；②非特異性治療性疫苗。第二節治療性疫苗的種類123、根據所用免疫原的種類可分為：①核酸型治療疫苗；②重組蛋白型治療疫苗；③天然蛋白型治療疫苗；④免疫復合物型治療疫苗；⑤嵌合型治療疫苗。3、根據所用免疫原的種類可分為：13（一）非特異性治療性疫苗（nonspecificcuringvaccine）這類疫苗的特點為屬非特異地誘生機體的細胞免疫應答，其作用較弱，一般均作為聯合治療的一部分。如卡介苗主要用于非特異地提高機體的細胞免疫，但作用較弱而被用作一種協同治療，聯合用于腫瘤病人。除卡介苗外，短小棒狀桿菌（革蘭氏陽性桿菌）以及其他的一些細菌均曾被用作非特異的治療性疫苗。（一）非特異性治療性疫苗（nonspecificcuri14（二）細菌型治療性疫苗（bacteriacuringvaccine）細菌性感染因有抗生素等治療，可以控制，故治療性疫苗僅限于少數幾種慢性感染，如結核病、麻風病及布魯氏病等。20世紀初，為治療金黃色葡萄球菌引起的反復發作的癤及癰，Wright采用自患者分離的加熱滅活的葡萄球菌為治療性疫苗，獲得成功，奠定了細菌型治療性疫苗的基礎。（二）細菌型治療性疫苗（bacteriacuringva151986年Convit曾報道聯合使用滅活的麻風菌苗與卡介苗治療300名麻風病人，結果可使60%的嚴重麻風病人病灶中清除麻風菌，并且降低了復發率。其機制為病人的特異性細胞免疫得以提高，并不再對麻風桿菌處于耐受狀態。倫敦大學醫學院的Stanford，從烏干達的土壤中分離了一株分支桿菌（Mycobacteriumvaccae），并用滅活的該菌苗聯合藥物治療結核患者，聯合療法使87%的患者治愈，而單用藥物治療的患者僅有78%治愈。

1986年Convit曾報道聯合使用滅活的麻風菌苗與卡介苗治16近來，已經開始研究針對幽門螺桿菌感染的治療性疫苗。由于幽門螺桿菌引起的感染為慢性，加上長期用藥后總會發生耐藥性，開展這一治療性疫苗的研究有一定價值。近來，已經開始研究針對幽門螺桿菌感染的治療性疫苗。由于幽門螺17（三）病毒型治療性疫苗（viruscuringvaccine）在病毒型疫苗中研究的最多的是：生殖道單純皰疹的治療性疫苗，慢性乙肝治療性疫苗，HIV感染的治療性疫苗。目前這些疫苗已有臨床研究的資料。此外，也有學者在研究HCV，人類乳頭狀瘤病毒疫苗，并認為有可能用于治療患者。

（三）病毒型治療性疫苗181、單純皰疹治療性疫苗1987年Stanberry等在豚鼠的生殖道模型中發現，用HSV作預防性免疫，不僅可預防HSV感染，還可減少75%的病毒發作的次數與縮短病期。用克隆表達的HSV糖蛋白gD2也同樣有效。實驗中，疫苗明顯地誘生了對HSVⅡ的中和抗體，并且使對gD2的抗體效價增高了4倍。由于抗體的效價并不與HSV的復發呈相關性，認為疫苗的效果可能與細胞免疫或細胞因子有關。治療性疫苗可以改變病毒慢性感染（持續性感染）的病程。結果還提示可進一步修飾gD2抗原，或改變佐劑以提高療效。1、單純皰疹治療性疫苗192、人類免疫缺陷病毒（HIV）的治療性疫苗

HIV感染導致的慢性進行性免疫缺陷，最終發生致死的嚴重后果。HIV的包膜抗原成分gp160曾經克隆表達后，先用于正常人體，證明無毒性，以后1991年用于治療30名處于HIV感染第1、2期的患者。

2、人類免疫缺陷病毒（HIV）的治療性疫苗20最近，除gp160外，其他的HIV的包膜抗原，如gp120，p24病毒樣顆粒、重組的金絲雀痘病毒gp160等疫苗均仍在研究中。第12屆世界艾滋病大會，Valentine等已報道，用多種藥物先治療，再用滅活、但去除了gp120的疫苗免疫，可誘生強而顯著的對p24的細胞增殖應答。這些發現又一次激發了對HIV治療性疫苗的研制熱情。最近，除gp160外，其他的HIV的包膜抗原，如gp120，213、人類乳頭狀瘤病毒治療性疫苗

人類乳頭狀瘤病毒（HPV）可引起皮膚疣，生殖道疣等，其中的某些類型是潛在的致宮頸癌的病毒。1999年已報道美國學者用HPV的L2E7融合基因表達蛋白治療25名生殖道疣的II期臨床研究結果。應用重組表達的HPV蛋白與Aldrogel（氫氧化鋁類）共免疫，25名患者在治療后8周完全清除了生殖道疣。3、人類乳頭狀瘤病毒治療性疫苗22（四）裸核酸型治療性疫苗（nakednucleicacid）1993年經Merck公司在流感病毒預防性疫苗的研制中證實，裸DNA確有免疫原性后，已成為全球疫苗研究的最熱點。作為治療性疫苗，裸DNA已被用于治療腫瘤、自身免疫病、傳染病等。（四）裸核酸型治療性疫苗231、裸核酸作為治療性疫苗（DNA疫苗）的優點（1）誘生表位-靶向免疫應答（2）擴大免疫原性的幅度（3）誘生CTL（4）便于加入免疫調控因子1、裸核酸作為治療性疫苗（DNA疫苗）的優點242、DNA疫苗用于腫瘤治療用基因工程的方法修飾腫瘤細胞或免疫細胞，使其分泌某些細胞因子從而可誘生炎癥反應或免疫應答，達到清除腫瘤的效果。由于腫瘤中很少具有特異性抗原，因此只能用轉染細胞因子的基因進行研究。在腫瘤DNA免疫治療中的另一個問題是，多次注入轉染的基因細胞后，是否會引起對細胞因子的免疫應答而失效或造成不良后果。2、DNA疫苗用于腫瘤治療253、DNA疫苗用于治療自身免疫病為研究DNA免疫是否可用于治療自身免疫病，學者們用鼠的實驗性自身免疫性腦炎（EAE），一種T細胞介導的自身免疫病模型進行了研究。實驗證明，用針對致病V基因產物的單克隆抗體，或用致病性TCRV區的抗原決定簇合成肽免疫，均有治療自身免疫性腦炎（EAE）的作用。這一結果顯示DNA免疫在自身免疫病中可使TH1類免疫應答向TH2類免疫應答轉化，從而對具有對多發性硬化癥，青年型糖尿病，類風濕性關節炎等自身免疫性疾病有潛在的治療作用。3、DNA疫苗用于治療自身免疫病264、DNA疫苗用于治療結核病對于DNA免疫預防結核病的研究，在小鼠中顯示了很好的效果。Tascon于1996年用編碼分枝桿菌65kDa熱休克蛋白（hsp65）的質粒DNA免疫小鼠，動物不僅可誘生特異的體液與細胞免疫，還可抵抗用結核桿菌的攻擊。DNA免疫所獲得的免疫保護作用可與用卡介苗免疫的效果相同。用hsp65蛋白免疫鼠則無此作用。4、DNA疫苗用于治療結核病27用編碼分枝桿菌另一種蛋白（36kDa富含脯氨酸）的DNA免疫也對小鼠具有保護作用。當以hsp65DDNA和IL-12DNA聯合免疫則反而效果下降，說明互相有拮抗作用。當先用化療，再用DNA免疫，則可清除結核菌，誘生特異的體液和細胞免疫。用編碼分枝桿菌另一種蛋白（36kDa富含脯氨酸）的DNA免疫285、DNA疫苗用于治療艾滋病

用編碼HIV的gp160的DNA疫苗肌肉注射免疫，在動物中可誘生抗體。在猴免疫缺陷病毒感染的模型中，HIVDNA免疫也顯示有一定療效。Calarota等（1998）用編碼HIV調控因子的基因組建的DNA疫苗治療了9名無癥狀的HIV感染者，結果8名患者產生了特異的CTL，并且未發生副反應。MacGregor等（1998）對15例無癥狀的HIV感染者，用編碼env和rev的DNA疫苗進行了注射。有些患者出現了gp120的抗體或對gp160的CTL。臨床顯示DNA免疫的安全性和潛在的肝免疫原性。5、DNA疫苗用于治療艾滋病29第三節乙型肝炎復合物型治療性疫苗（CuringvaccineofCompoundHBV）一、乙型肝炎治療性疫苗的研究進展（researchadvance）80年代初國外已有報道用乙肝預防性疫苗治療HBsAg陽性兒童，無癥狀攜帶者及慢性肝炎患者的臨床研究，均被證明無效。從90年代初，法國學者又開始了用預防性疫苗治療乙肝患者的研究。1994年Pol等用重組GenHavacB疫苗（CHO細胞表達）的HBsAg+PreS2,20μg/次，每月一次，共三次，治療慢性乙肝患者，以后進一步用疫苗治療加用干擾素，結果32名患者31%血清HBVDNA轉陰，4名降低（13%）。第三節乙型肝炎復合物型治療性疫苗30此后，巴斯德研究所開展了多中心雙盲對照的大規模臨床研究；Coullin等于1999年已報道在治療者中，27名患者中的7名出現了對HBsAg的特異性淋巴細胞增殖反及釋放更高的TH1類的細胞因子。我國在這一研究中缺少雙盲對照，及所用檢測試劑的標準化與可比性間尚有不足之處。此后，巴斯德研究所開展了多中心雙盲對照的大規模臨床研究；Co31Chisari等以HBsAg為治療性疫苗的病毒表位也做了許多工作。他們找到了能在HLAA2人體中誘生CTL應答的表位肽（p18-27）；Vitello等（1995）用該肽加入破傷風類毒素肽p830-843，再加入2個分子的棕閭酸作為類脂成分，制成的治療性疫苗（商品名為TheradigmHBV），可100%的誘生CTL。

Chisari等以HBsAg為治療性疫苗的病毒表位也做了許多32在裸核酸免疫（DNA免疫）治療性方面，用轉基因鼠取得了很有希望的結果。法國學者（Michel，1995）首先在正常鼠中證明，以編碼有HBsAg100μg的裸DNA免疫可引起細胞及抗體免疫應答。Shimizu等（1998）在5種不同品系的HBV轉基因鼠中發現，體外用細胞因子激活樹突狀細胞（DC），可以有效地激活轉基因鼠中的CTL，并認為處理DC較DNA免疫更強。在裸核酸免疫（DNA免疫）治療性方面，用轉基因鼠取得了很有希33二、免疫復合物型乙型肝炎治療性疫苗（ImmunocompoundCuringVaccineforHBV）我國863高技術計劃支持下，早在1988年起，已開始了對治療性乙肝疫苗的研究。根據我國多數乙肝患者是幼齡感染乙肝病毒，加之慢性乙肝患者血清中無有效的抗HBsAg抗體及細胞免疫應答，研究課題組提出了多數患者處于對HBsAg免疫耐受的狀態，而治療性疫苗的抗原應以HBsAg為靶抗原，通過消除機體對HBsAg的免疫耐受性，以產生有效免疫應答的治療患者的路線。分以下階段進行。二、免疫復合物型乙型肝炎治療性疫苗341、建立動物實驗模型

利用鴨乙肝動物模型，研究幼齡感染鴨是否可造成模擬人感染的對HBsAg的免疫耐受狀態。在獲得確可建立實驗動物模型的基礎上，確立了免疫耐受動物模型的標準，規定了觀察時間，以及判斷消除免疫耐受狀態的指標，建立了可供研究人乙肝免疫耐受狀態的動物模型并進行了消除免疫耐受性的實驗研究。1、建立動物實驗模型352、探討消除免疫耐受狀態的治療策略在主動免疫與被動免疫中進行了選擇。主動免疫的優點為：注入有效的免疫原方法簡單，安全性較高，通過調動機體本身的免疫應答，故有效持續的時間可較長。其缺點為，如患者的免疫應答普遍低下，則效果會較差。2、探討消除免疫耐受狀態的治療策略36被動免疫包括輸入經細胞因子激活或改造的自身免疫細胞或輸入具有對HBsAg強免疫應答的他人免疫細胞等。由于已證實被動輸入抗HBs僅能短暫使血清中的HBsAg滴度下降，并無治療作用，故不再考慮。被動免疫的操作復雜，選擇對象嚴格，需特別防止污染，醫療環境的要求高。鑒于慢性乙肝感染者不同于HIV感染者或腫瘤患者，一般具有對抗原刺激的正常應答，僅為對HBsAg有免疫耐受，因此可定位于主動免疫。被動免疫包括輸入經細胞因子激活或改造的自身免疫細胞或輸入具有37主動免疫策略為：①改變抗原組分，使機體從免疫耐受轉為識別抗原而產生免疫應答；②調節抗原提呈的方式或途徑，使機體對經調節后提呈的HBsAg產生免疫應答。主動免疫策略為：383、改變抗原組分在鴨乙肝病毒包膜抗原中用合成肽段及用合成肽免疫動物的方法，選擇強免疫原性決定簇。最終發現鴨乙肝病毒PreS的第125~146氨基酸的免疫原性強，用該肽段免疫所獲得的抗體可與天然鴨乙肝病毒包膜結合。美學者證實該肽段位于中和性抗原表位中，更明確可用此肽作為候選治療性疫苗。用該肽段與破傷風類毒素交聯免疫耐受鴨，可以使50%鴨的病毒DNA轉陰，但多次應用后效果未見提高。此后進行了用雙肽共免疫的主動免疫法。3、改變抗原組分39將鴨乙肝病毒包膜PreS125-146肽與破傷風類毒素中的830-843（能有效地激活T細胞的肽）共免疫耐受鴨，試圖消除免疫耐受，效果比前一種組分更差。合成肽的結果說明，試圖單用合成肽組分制備治療性疫苗的途徑以消除對乙肝病毒的免疫耐受性，成功的機會極少。將鴨乙肝病毒包膜PreS125-146肽與破傷風類毒素中的8404、調節抗原提呈途徑或方式對鴨乙肝病毒包膜抗原進行了三種不同的調節抗原提呈實驗。①首先獲得了鴨乙肝病毒編碼的DHBsAg+PreS克隆，再通過與痘苗病毒重組，獲得在細胞中可表達鴨乙肝病毒包膜抗原的重組痘苗。在正常鴨中，接種該重組株后，鴨血清中可測及DHBsAg。證明這一重組痘苗可在鴨體內表達抗原后，用以在免疫耐受鴨中進行治療。結果顯示，結合痘苗病毒的復制與抗原調節提呈DHBsAg，并不能有效地消除免疫耐受性。

4、調節抗原提呈途徑或方式41②第二種調節的途徑為，通過將DHBsAg與葡萄球菌CowanI株，及抗DHBsAg組建成固相抗體抗原免疫原性復合物（SMAA），以調節DHBsAg的抗原提呈。用SMAA免疫耐受鴨后，可在約50%的耐受鴨中清除DHBsAg，在60%~70%鴨中清除病毒DNA，并在部分鴨中產生了抗DHBs。在SMAA實驗中發現，單用DHBsAg+抗DHBsAg組建免疫原性復合物（IC，immunogeniccomplex），也具有可以在約50%耐受鴨中清除病毒及DHBsAg的作用。

②第二種調節的途徑為，通過將DHBsAg與葡萄球菌Cowan42③第三種對調節DHBsAg抗原提呈的研究是用抗原加特異的抗體可提高抗原的免疫原性，但用這種制劑消除免疫耐受的途徑未見報道。經多次實驗證實DHBsAg+抗DHBsAg組建成復合物，確能消除部分鴨的免疫耐受性。這一種治療性疫苗的研制已獲我國發明專利（1997年授權）。③第三種對調節DHBsAg抗原提呈的研究是用抗原加特異的抗體435、研制并開發可供人體應用的治療性疫苗為盡快開發，可供人體應用的治療性疫苗，選擇了乙肝疫苗及人高效價抗乙肝免疫球蛋白（HBIG）組建免疫復合物型治療性疫苗。在抗原抗體配比，制備疫苗的工藝，產品標化，效力試驗的參比實驗等技術方面進行了研究，與下游單位協同合作，現已進入中試。5、研制并開發可供人體應用的治療性疫苗446、研究復合物型疫苗的作用機制

為研究復合物型疫苗的作用機制，選用了免疫學基礎研究較成熟的小鼠為研究模型。結果證明復合物型乙肝治療性疫苗的作用機制為:1）通過復合物中抗體的Fc段，與抗原提呈細胞表面的Fc受體結合，促進了細胞攝取抗原。當用酶消化去除抗HBs的Fc段，雖可形成抗原-抗體Fab段的復合物，但不能增強被巨噬細胞所攝取。6、研究復合物型疫苗的作用機制45當用異種動物（如羊）的抗HBs組建復合物，因與鼠的巨噬細胞的Fc受體不相應，也不能促進抗原的攝入與提呈。2）復合物中的抗原經提呈后可比單純抗原更有效地激活T細胞增殖，釋放更多的γ-干擾素和IL-2，屬TH1類應答。復合物在正常小鼠中誘生的抗HBS較單純抗原誘生的抗體高10倍以上。當用異種動物（如羊）的抗HBs組建復合物，因與鼠的巨噬細胞的46

第四節治療性疫苗的開發現狀（exploitationstatusofcuringvaccine）目前，全世界發達國家與發展中國家的多數政府與企業均投入大量人力與物力開發治療性疫苗。①微生物的重組蛋白疫苗，因其抗原性及保護性抗原明確，而且預防性疫苗應用的基礎較扎實，容易被批準，是開發的熱點，短期內可見效果。第四節治療性疫苗的開發現狀47②腫瘤及自身免疫病的治療性疫苗中的少數可能會有所發展，以腫瘤的可能較大，并且是作為綜合治療的一部分。③DNA疫苗今后在一些微生物感染中的治療性疫苗的作用不可低估。現將所公布的治療性疫苗的開發現狀列于表8-1。②腫瘤及自身免疫病的治療性疫苗中的少數可能會有所發展，以腫瘤48表8-1治療性疫苗的開發現狀治療性疫苗針對的疾病公司或單位研制或臨床研究階段皰疹病毒感染Biocine，RaeLynBurke臨床Ⅱ/Ⅲ期SmithKlineBeecham臨床Ⅱ/Ⅲ期MoncelSlaoul臨床Ⅱ/Ⅲ期乙型肝炎

上海醫科大學（863）計劃與北京生物制品研究所臨床前期

巴斯德研究所臨床Ⅱ/Ⅲ期Vical動物實驗階段Cytel臨床Ⅰ/Ⅱ期Viagene臨床Ⅰ/Ⅱ期SmithKlineBeecham臨床Ⅱ期表8-1治療性疫苗的開發現狀治療性疫苗針對的疾病公司或49病毒性疣Laceyetal臨床Ⅱ期

愛滋病Oleske（FrancisXavierBaground）臨床Ⅱ期瑞典Karolinska研究所等臨床Ⅰ期美國NIH臨床Ⅰ期結核病J.Stanford（美、英）臨床Ⅲ期印度臨床Ⅲ期英國醫學研究委員會動物實驗

麻風病Convit（委內瑞拉）臨床Ⅲ期Talwar（印度）臨床Ⅲ期利什曼體Convit（委內瑞拉）臨床Ⅲ期病毒性疣Laceyetal臨床Ⅱ期Oleske（50

第五節我國治療性疫苗的開發戰略