課題3血紅蛋白的提取和分離專題5DNA和蛋白質技術思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質的生物大分子。思考2蛋白質的分離和提取的原理是什么？根據蛋白質各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質和多少、溶解度和吸附的性質和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質。思考3人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。一、基礎知識：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，由多糖類構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）2、概念：根據被分離物質的蛋白質相對分子質量的大小，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，相對（）的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質量不同的蛋白質因此得以分離。4、具體過程分子質量較小較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快凝膠色譜法分離蛋白質的原理1、概念：在一定的范圍內，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（）的對溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值3、緩沖溶液的配制

通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調節緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內

思考：說出人體血液中緩沖液。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3㈢電泳：1、概念：指帶電粒子在電場作用下發生遷移的過程。

在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內的pH環境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察和科學研究2、原理：許多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，這些基團會帶上（）。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其（）移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子（）以及分子本身（）、（）的不同使帶電分子產生不同的（），從而實現樣品中各種分子的分離。多肽、核酸可解離的基團正電或負電所帶電荷相反的電極帶電性質的差異大小形狀遷移速度一定的pH分類：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。測定（）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質相對分子質量電泳檢測結果瓊脂糖凝膠電泳

二、實驗操作樣品處理→粗分離→純化→純度鑒定（一）蛋白質提取和分離步驟（二）操作過程

(1)紅細胞的洗滌:①洗滌目的:

去除雜蛋白，以利于后續血紅蛋白的分離純化，洗滌次數不可過少。②洗滌操作：

1、采集血樣。2、低速短時間離心（速度越高和時間越長，會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀，達不到分離的效果）3、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。4、鹽水洗滌：用五倍體積的質量分數為0.9％的氯化鈉溶液洗滌。5、低速離心（低速短時間）6、重復4、5步驟三次，直至上清液中已沒有黃色，表明洗滌干凈。(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：

①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。(4)透析：

①過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。②透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質。原理：透析袋能使小分子自由進出，而大分子保留在袋內。透析過程動畫演示凝膠色譜操作:（1）凝膠色譜柱的制作：

①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。（2）凝膠色譜柱的裝填①凝膠的前處理：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。

②凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。

③洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。50cm高（3）樣品加入與洗脫

①調節緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續收集。

（3）樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環繞移動。練習鞏固1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質的空間結構B弄清各種蛋白質的功能C弄清各種蛋白質的合成過程D獲得高純度的蛋白質2、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是A相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D二者根本無法比較3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調節pHB維持紅細胞的能