抗原決定簇的確立和選擇抗原表位--定義抗原表位，又稱抗原決定簇(antigenicdeterminant，AD)，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區，負責與抗體分子或免疫細胞表面的抗原受體結合。嚴格說來，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的。抗原通過抗原表位與相應的淋巴細胞表面的抗原受體結合，從而激活淋巴細胞，引起免疫應答；抗原也借表位與相應抗體或致敏淋巴細胞發生特異性結合而發揮免疫效應。抗原表位的性質、數目和空間構型決定抗原的特異性。2抗原決定簇的確立和選擇抗原分子以其B細胞表位與抗體分子的抗原結合部位發生互補性結合A.抗原--抗體復合物的立體構象；B.采用電腦技術將抗原和抗體分子分開，可見抗原和抗體分子的相互作用僅發生在抗原分子的B細胞表位和抗體分子的抗原結合部位之間，兩者呈現結構互補。C.抗體的互補決定區與抗原表位結合示意圖C3抗原決定簇的確立和選擇一般情況下，一個多肽表位含5~6個氨基酸殘基；一個多糖表位含5~7個單糖；一個核酸半抗原的表位含6~8個核苷酸。抗原表位的大小與相應抗體的抗原結合部位相適合。一個抗原表位的特異性由組成它的所有殘基共同決定，但其中有些殘基在與抗體結合時比其它殘基起更大作用，這些殘基被稱為免疫顯性基團。

4抗原決定簇的確立和選擇抗原表位--分類覆蓋型和非覆蓋型表位

某些抗原分子表面，不同表位之間相對分離，各自結合特異性抗體，互不影響，這類表位被稱為非覆蓋型表位。若某一表位與相應抗體結合會影響另一表位與抗體的結合，此類表位稱為覆蓋型表位。

功能性和隱蔽表位

位于抗原分子表面的表位易被相應淋巴細胞所識別，即具有易接近性，可直接啟動免疫應答，故稱為功能性表位。存在于抗原分子內部的表位無直接觸發免疫應答的功能，稱為隱蔽表位。若通過理化因素處理抗原，使其結構發生改變，內部的隱蔽表位被暴露，可能成為新的有功能的表位。

5抗原決定簇的確立和選擇按表位結構不同，分為連續性抗原表位和不連續性抗原表位。連續性表位又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續的氨基酸組成通常這種結合比較弱，因為小肽并不含完整天然蛋白的構象，在多數情況下這種表位可能只代表了復雜表位的一部分。對其研究依賴于多肽固相化學合成技術。后者又稱構象型抗原表位，是由那些空間鄰近但順序上不連續的氨基酸組成。

分類6抗原決定簇的確立和選擇

按照與抗原受體細胞結合不同，分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。分類特性T細胞表位B細胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需無需表位性質主要是線性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、有機化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15個氨基酸，5-7個單糖或5-7個核苷酸表位類型線性表位構象、線性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面7抗原決定簇的確立和選擇研究意義表位是蛋白質抗原性的基礎，研究蛋白質抗原表位，對于設計具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型診斷試劑具有較大意義。應用：多在診斷與疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特異性診斷試劑盒中更為重要。8抗原決定簇的確立和選擇抗原表位研究方法通過化學或生物學方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克隆抗體篩選能與之起陽性反應的片段。1.1用化學法或酶“切割”抗原，分離抗原肽段該法對蛋白質的一級結構不作要求，但測定結果只能是抗原的線性表位。化學切割法中常用的試劑：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8蛋白酶等。水解后采用各種分離方法如SDS-PAGE、凝膠過濾、離子交換將水解片段分開，然后用Westernblot，ELISA等各種檢測手段來檢測。結果可通過理論肽段分子量的推斷或相應的氨基酸序列分析來判斷。利用該法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌細胞增強蛋白、乙酰膽堿酯酶、玻璃體結合蛋白、磷脂酶基質蛋白等。1.傳統化學“切割”法或酶法（classicalepitopemapping）9抗原決定簇的確立和選擇研究方法1.2水解抗原-抗體復合物這是一個直接的確定線性及構象性抗原表位的方法，又稱為Proteinfootprinting。其理論依據為抗原--抗體復合物的結合部位能抵抗蛋白酶的水解。根據蛋白質抗原性質的不同常采用3種方法。對于蛋白酶水解位點較少的抗原，一般先將抗原與等摩爾抗體在PBS中反應，然后酶解，SDS分離水解產物，分析結果。對于蛋白酶水解位點較多的抗原，采用HPLC法，將抗原--抗體復合物的酶解片段和同樣條件下的抗原酶解片段分別用HPLC分析。兩者圖譜對應峰峰高比大于平均數值的片段則推測為抗原表位。對于能確定為線性表位的抗原可先將抗體連接于固相載體上，并將此固相載體裝柱，然后讓過量的抗原溶液通過此柱，使抗原-抗體形成復合物。一定條件下，酶溶液過柱，酶解此抗原-抗體復合物，PBS洗去酶解下的不結合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下與抗體結合的肽段。HPLC分析這些片段以確定結果。近來，質譜技術在這類結果分析中得到了廣泛的應用。采用該法已成功地確定了細胞色素C，胃泌素釋放肽(GRP)，脂堿性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。10抗原決定簇的確立和選擇2.合成肽庫方法有機合成法就是直接利用固相肽合成技術，合成含有各種可能序列的短肽。通過這種合成可以保證各種序列的多肽等機率出現，每個載體上只含有一種序列的短肽。優點是構建方法簡單，迅速。缺點是不能擴增，篩選比較麻煩，需進行熒光標記或ELISA，在顯微鏡下操作工作量比較大。在研究構象性表位時的minotopes方法即采用類似的方法，通常從二肽開始合成并逐漸增加肽鏈長度及置換氨基酸種類，直至達到與抗體的最大結合為止。研究方法2.1有機合成法肽庫是大量某一長度(如六肽)的短肽的集合，它包括了該長度的短肽的各種可能序列或其中的絕大部分。11抗原決定簇的確立和選擇該法先利用基因克隆技術將合成的一組寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至線性噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式在噬菌體的外殼蛋白的氨基端表達。再利用生物素或酶標記的抗體篩出特異的噬菌體，并進行擴增，再篩選，從結合特異抗體的噬菌體DNA序列推斷出氨基酸序列，并合成相應的短肽，驗證篩選結果。用此法檢測的抗原表位有人H鐵蛋白、藍舌病病毒的外殼蛋白VP5等。研究方法2.2

基因工程法（噬菌體隨機肽篩選法）12抗原決定簇的確立和選擇此技術于1992年由R.Frank發展出來，它主要是將涵蓋所有抗原氨基酸序列的縮氨酸合成于固定的表面，并與抗血清標定，此法可鑒定線性抗原表位。應用肽合成技術合成連續的重疊的5～7肽，將這些合成的肽與相應的抗體反應，分析檢測結果，以確定陽性反應片段。這一技術要求有明確的抗原的一級結構，并且檢測結果為抗原線性表位。該法應用廣泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生蟲蛋白、煙草花葉病毒(TMV)、Fy6蛋白、鴨肝炎B病毒(DHBV)等。

3縮氨酸掃描技術(PeptideScantechnology)研究方法13抗原決定簇的確立和選擇4表位作圖早期表位作圖或定位(epitopemapping)是基于蛋白質修飾和降解的原理，可經側鏈化學修飾法選擇性地標記氨基酸，失去結合的部分將被測出。蛋白質抗原被降解為小片段，經測序后確定抗體結合的位點。要確定某一抗原的全部表位需要大量的時間。現已可以通過誘變、蛋白質合成或蛋白競爭結合方法鑒定其表位。此外，表位序列測定的應用對抗體結合表位的分析具有顯著的優越性。研究方法14抗原決定簇的確立和選擇研究方法--表位作圖方法構象表位線性表位條件精確度競爭分析方法是，但并非經常是標記抗體、抗原僅確定空間位置競爭基因片段表達法是，但并非經常是必須克隆，DNA(已知基因序列)構象50-200個氨基酸線狀10-20個氨基酸合成肽庫法否是必須建立肽庫完全繪制3-15推薦使用表位作圖方法和基本條件15抗原決定簇的確立和選擇研究方法從80年代Hopp和Woods提出親水性參數對抗原表位預測的方法以來，已有許多參數、算法發表，對B細胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動作用。現已被大眾認可并具有較好預測效果的方法，主要有以下6種：5抗原表位的預測法16抗原決定簇的確立和選擇(2)可及性方案(Accessibility)如Janin可及性參數，指蛋白質抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性。它反映了蛋白質抗原內、外各層殘基的分布情況。B細胞抗原表位的預測法18抗原決定簇的確立和選擇(3)抗原性方案(Antigenicity)對20個已研究得很透的蛋白質的69個連續位點的606個氨基酸統計分析，Welling建立了抗原性刻度。每個氨基酸用出現在抗原區的頻率描述，此頻率除以各氨基酸在所有蛋白質中的頻率就可推出此刻度值。該法研究表明，疏水性氨基酸殘基對抗原表位形成亦有貢獻。缺點是其所用的數據庫有限，并且連續位點內的殘基被認為是同等重要的。顯然那些不重要的殘基歸入計算會明顯降低相關性。抗原表位的預測法19抗原決定簇的確立和選擇(4)可塑性方案(Flexibility)指蛋白抗原構象不是剛性不變的，其多肽鏈骨架有一定程度的活動性，活動性強的氨基酸殘基即可塑性大的位點，易形成抗原表位。Karplas和Schulz基于已知結構的31個蛋白質，發展了一種預測蛋白質片段活動性的方法。(5)電荷分布方案(Chargedistribution)認為對堿性抗原特異的抗體多趨于酸性，對酸性抗原特異的抗體多趨于堿性。抗原表位的預測法20抗原決定簇的確立和選擇(6)二級結構預測方案(Secondarystructure)認為β轉角結構為凸出結構，多出現在蛋白質抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。而α螺旋、β片層結構規則不易形變，較難嵌和抗體，一般不作為抗原表位。可預測蛋白質β轉角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各種方法預測的成功率均不超過65%。一般認為Cohen方法對轉角的預測正確率很高，對于已知折疊類型的蛋白質(αα類，ββ類，α/β類)正確率高達95%，對于未知結構類型的蛋白質，可用3種類型分別預測，3類預測一致的轉角對預測表位有幫助。抗原表位的預測法21抗原決定簇的確立和選擇對上述各種參數的預測比較表明，各種方案預測的正確率均不高。一般將上述多種方案綜合考慮，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二級結構預測為重要。已經有一些文獻提出了各自不同的綜合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一種綜合預測方案。權重選擇為：40%來自二級結構成分，可及性、柔韌性各15%，30%來自親水性。在吳加金等編的Goldkey軟件中，以六種參數Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，Flexibility，Charge，Antigenivity綜合考慮，得出綜合判斷圖，閾值以上的峰即認為是預測的抗原表位。從軟件預測出的抗原表位須用實驗來進一步驗證。抗原表位的預測法22抗原決定簇的確立和選擇以往合成的序列肽僅模擬蛋白質的線性表位，這無疑會遺漏眾多的構象性表位信息。近些年來,隨著生物信息學和分子生物學技術的飛速發展，采用計算機預測和試驗相結合的方法進行構象性表位分析和定位得到了迅速發展，一些可用的基于Web的預測軟件已經公布，如CEP軟件、DiscTope軟件和MEPS軟件。應用噬菌體展示肽庫技術結合計算機建模進行構象性表位預測是另一類預測B細胞構象性表位的方法。即利用抗體篩選噬菌體肽庫，獲取抗體親和性模擬肽，對模擬肽集合進行比對處理，獲得探針基序，然后利用探針基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列，獲得的序列即作為預測結果。1990年Scott首次將噬菌體隨機肽庫技術應用于抗原定位。目前提供的基于Web的預測服務算法有Pepitope算法、3DEX算法和MIMOX算法。B細胞構象表位的預測23抗原決定簇的確立和選擇T細胞表位預測主要基于候選肽能否和MHC分子結合。T細胞表位預測分CTL表位預測和Th表位預測兩類,其中CTL表位預測主要涉及MHCⅠ類分子肽預測,Th表位預測涉及MHCⅡ類分子的親和肽預測。與MHCⅠ類分子結合的多肽長度通