1.2基因工程的基本操作程序1編輯ppt知識回顧：基因工程基本操作的四個步驟1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構建3、目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可進行遺傳、表達和發揮作用

載體進入受體細胞穩定表達，才能實現一種生物的基因在另一種生物中的轉化。

才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩定遺傳和正確表達。2編輯ppt一、目的基因的獲取1目的基因主要是編碼蛋白質的基因：如：與生物抗性相關的基因、與優良品質相關的基因、與生物藥物和保健品相關的基因、與毒物降解相關的基因、與工業用酶相關的基因、具調控作用的因子等。2獲取目的基因的常用方法：1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成3編輯ppt原核細胞的基因結構非編碼區非編碼區編碼區編碼區上游編碼區下游與RNA聚合酶結合位點啟動子終止子①不編碼蛋白質。：編碼蛋白質,連續不間斷編碼區非編碼區②調控遺傳信息表達,上游有RNA聚合酶結合位點:基因結構4編輯ppt真核細胞的基因結構編碼區非編碼區非編碼區內含子外顯子啟動子終止子編碼區上游編碼區下游編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用,上游有RNA聚合酶結合位點(啟動子)。與RNA聚合酶結合位點基因結構5編輯ppt1.從基因文庫中獲取目的基因1.基因文庫的概念:將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因。2.基因文庫的種類:基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫6編輯ppt基因組DNA文庫與cDNA文庫某生物體內全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運載體連接導入基因組文庫cDNA反轉錄受體菌群體與運載體連接導入cDNA文庫某種生物某個時期的mRNA7編輯ppt真核細胞的cDNA的獲取編碼區非編碼區非編碼區DNA聚合酶剪接有關的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉錄酶轉錄剪接逆轉錄復制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區和內含子8編輯ppt基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以9編輯ppt③怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因根據目的基因的有關信息，例如，根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因。10編輯ppt2.利用PCR技術擴增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。2原理：DNA復制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩定DNA聚合酶多聚酶鏈式反應體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列11編輯pptPCR技術的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復性55℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復a.b.c步驟：每重復一次，目的基因增加___倍一12編輯ppt5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G變性復性延伸1.目的基因DNA受熱變性，解鏈；2.引物與單鏈互補結合；3.合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ13編輯ppt③過程：14編輯pptPCR技術的操作過程PCR反應體系中目的基因成指數(2n)形式擴增15編輯pptPCR技術擴增與DNA復制的比較堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復制、邊解旋變復制半保留復制、全解旋再復制體外復制主要在細胞核內大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶、解旋酶、DNA連接酶等16編輯pptPCR技術擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成_______

b、復性（55℃-60℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈17編輯ppt3.人工合成法

在基因較小，核苷酸序列已知的情況下，可以利用DNA合成儀人工合成蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學合成推測推測思考：化學法合成的目的基因含內含子、啟動子和終止子嗎？18編輯ppt人工合成法（真核生物）反轉錄法目的基因的信使RNA目的基因化學合成法肽鏈氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推測推測單鏈DNA合成19編輯ppt課堂小結目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫20編輯ppt二、基因表達載體的構建——基因工程的核心1目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。2基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因21編輯ppt二、基因表達載體的構建——核心（1）用一定的_________切割質粒，使其出現一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:22編輯ppt基因表達載體的構建——核心質粒DNA分子一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。表達載體過程:23編輯ppt基因表達載體的構建——基因工程的核心

1、目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。24編輯ppt2、基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因它們各自的作用是什么?25編輯ppt啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來26編輯ppt3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是mRNA結合位點位于基因的末端,終止轉錄檢測目的基因是否導入受體細胞27編輯ppt三、將目的基因導入受體細胞1轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。2常用的受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農桿菌、酵母菌和動植物細胞等。3目的基因導入受體細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。28編輯ppt1、目的基因導入植物細胞的方法（1）農桿菌轉化法①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力。②原理：Ti質粒上的T---DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。29編輯ppt三、目的基因導入受體細胞構建基因表達載體轉入農桿菌植物細胞導入穩定維持和表達③過程：30編輯ppt1、目的基因導入植物細胞的方法（2）基因槍法：目的基因導入單子葉植物細胞①操作方法：利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。②

鎢粉粒子和金粉粒子，粒子的直徑一般在0.6～4um。③適用：單子葉植物31編輯ppt1、目的基因導入植物細胞的方法（3）花粉管通道法：將目的基因導入植物細胞①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞②

特點:十分簡便經濟。③例：轉基因抗蟲棉32編輯ppt2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法①程序目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵新性狀動物33編輯ppt3、將目的基因導入微生物細胞①微生物作受體細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少②常用菌：大腸桿菌③常用法：Ca2+處理獲得感受態細胞④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態

細胞感受態細胞吸收DNA表達載體與感受態細胞混合34編輯ppt小結：將目的基因導入受體細胞35編輯ppt四、目的基因的檢測與鑒定導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。2目的基因進入受體細胞后，是否都能穩定維持和表達？不一定，需要檢測36編輯ppt1、鑒定——分子水平的鑒定轉基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術變性變性37編輯ppt1、鑒定——分子水平的鑒定變性方法——分子雜交技術（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA探針15N15N轉基因生物的mRNA14N14N38編輯ppt1、鑒定——分子水平的鑒定提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質

出現雜交帶脫分化組織培養39編輯ppt2、鑒定——個體水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。40編輯ppt目的基因的檢測與鑒定檢測①導入檢測：目的基因是否導入受體細胞方法——DNA分子雜交②表達檢測轉錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定41編輯ppt目