第3章

蛋白質的基本結構單位—氨基酸

（aminoacid）一、蛋白質的水解二、氨基酸的分類三、氨基酸的理化性質四、氨基酸的分析分離（后講）完全水解得到各種氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各種氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白質的基本結構單元。大多數的蛋白質都是由20種氨基酸組成。這20種氨基酸被稱為基本氨基酸。1、酸水解常用6mol/L的鹽酸或4mol/L的硫酸在105-110℃條件下進行水解，反應時間約20小時。此法的優點是不容易引起水解產物的消旋化，得到的是L-氨基酸。缺點是色氨酸被沸酸完全破壞；含有羥基的氨基酸如絲氨酸或蘇氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺側鏈的酰胺基被水解下來。2、堿水解一般用5mol/L氫氧化鈉煮沸10-20小時。由于水解過程中許多氨基酸都受到不同程度的破壞，產率不高。部分的水解產物發生消旋化，其產物是D-型和L-型氨基酸的混合物。該法的優點是色氨酸在水解中不受破壞。3、酶水解目前用于蛋白質肽鏈斷裂的蛋白水解酶（proteolyticenzyme）或稱蛋白酶（proteinase）已有十多種。應用酶水解多肽不會破壞氨基酸，也不會發生消旋化。水解的產物為較小的肽段。最常見的蛋白水解酶有以下幾種：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶。二、α一氨基酸的一般結構α一氨基酸是一切蛋白質的組成單位。氨基酸是羧酸分子中α－碳原子上的一個氫原子被氨基取代而成的化合物，故稱α一氨基酸。例如丙酸的α－碳原子上的一個H被氨基取代即得丙氨酸。氨基酸有D-型及L-型氨基酸的D一型或L一型是以L一甘油醛或L一乳酸為參考的。三、氨基酸的分類（一）根據來源分：內源氨基酸和外源氨基酸（二）從營養學角度分：必需氨基酸和非必需氨基酸IleMetValLeu

Trp

Phe

ThrLysHis異亮蛋纈亮色苯丙蘇賴組（三）根據是否組成蛋白質來分：蛋白質中常見氨基酸、蛋白質中稀有氨基酸和非蛋白質氨基酸（四）按R基的化學結構：脂肪族：中性氨基酸、含羥基或硫氨基酸、酸性氨基酸、堿性氨基酸芳香族雜環族

（五）按R基極性分類20種常見氨基酸非極性R基團氨基酸：8種—AlaValLeuIle

PheProMetTrp(表3-2)極性不帶電荷R基團氨基酸：7種—SerThr

Asn

Gln

Try

Cys

Gly（表3-2）帶負電荷R基團氨基酸：2種—AspGlu帶正電荷R基團氨基酸：3種—LysArgHis1、蛋白質中常見氨基酸的結構

甘氨酸

Glycine

脂肪族氨基酸氨基乙酸唯一一個不具旋光性的氨基酸。中性氨基酸不帶電荷的極性R基氨基酸

中性氨基酸丙氨酸

Alanine-氨基丙酸脂肪族氨基酸非極性R基氨基酸

纈氨酸

Valine

中性氨基酸-氨基異戊酸脂肪族氨基酸非極性R基氨基酸

亮氨酸

Leucine

中性氨基酸-氨基異己酸脂肪族氨基酸非極性R基氨基酸

異亮氨酸

Ileucine

中性氨基酸-氨基--甲基戊酸脂肪族氨基酸非極性R基氨基酸

絲氨酸

Serine

含羥基氨基酸-氨基--羥基丙酸脂肪族氨基酸不帶電荷的極性R基氨基酸

蘇氨酸

Threonine

含羥基氨基酸-氨基--羥基丁酸脂肪族氨基酸不帶電荷的極性R基氨基酸

甲硫氨酸（蛋氨酸）

Methionine

含硫氨基酸-氨基--甲硫基丁酸脂肪族氨基酸非極性R基氨基酸

半胱氨酸

Cysteine含硫氨基酸-氨基--巰基丙酸脂肪族氨基酸不帶電荷的極性R基氨基酸

堿性氨基酸賴氨酸

Lysine，-二氨基己酸脂肪族氨基酸帶正電荷的R基氨基酸

堿性氨基酸精氨酸

Arginine-氨基--胍基戊酸脂肪族氨基酸帶正電荷的R基氨基酸

天冬氨酸

Aspartate

酸性氨基酸-氨基丁二酸脂肪族氨基酸帶負電荷的R基氨基酸

谷氨酸

Glutamate

酸性氨基酸-氨基戊二酸脂肪族氨基酸帶負電荷的R基氨基酸

芳香族氨基酸酪氨酸Tyrosine-氨基--對羥苯基丙酸不帶電荷的極性R基氨基酸

芳香族氨基酸色氨酸

TryptophanTrp-氨基--吲哚基丙酸非極性R基氨基酸

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine-氨基--苯基丙酸非極性R基氨基酸

雜環氨基酸組氨酸

Histidine-氨基--咪唑基丙酸堿性氨基酸帶正電荷的R基氨基酸

脯氨酸

Proline

亞氨基酸-吡咯烷基--羧酸雜環氨基酸非極性R基氨基酸

天冬酰胺

Asparagine含酰胺氨基酸不帶電荷的極性R基氨基酸

谷氨酰胺

Glutamine含酰胺氨基酸不帶電荷的極性R基氨基酸2.蛋白質中幾種重要的稀有氨基酸在少數蛋白質中分離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質氨基酸。這些氨基酸都是由相應的基本氨基酸衍生而來的。其中重要的有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質氨基酸的結構如下。

3.非蛋白氨基酸

廣泛存在于各種細胞和組織中，呈游離或結合態，但并不存在于蛋白質中的一類氨基酸，大部分也是蛋白質氨基酸的衍生物。-丙氨酸-氨基丁酸1.作為細菌細胞壁中肽聚糖的組分：D-Glu和D-Ala2.作為一些重要代謝物的前體或中間體:-丙氨酸（VB3）、鳥氨酸（Orn）、瓜氨酸（Cit）(尿素)3.作為神經傳導的化學物質：-氨基丁酸4.有些氨基酸只作為一種N素的轉運和貯藏載體（刀豆氨酸）5.調節生長作用6.殺蟲防御作用絕大部分非蛋白氨基酸的功能不清楚。

非蛋白氨基酸存在的意義：三、氨基酸的理化性質

除甘氨酸外，氨基酸含有一個手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常數之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據。（一）氨基酸的一般物理性質

1.氨基酸的旋光性2.氨基酸的光吸收構成蛋白質的20種氨基酸在可見光區都沒有光吸收，但在遠紫外區(γ<220nm)均有光吸收。在近紫外區(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。色氨酸的max＝280nm

酪氨酸的max＝275nm

苯丙氨酸的max＝257nm3.高熔點4.一般均溶于水，溶于強酸、強堿；不溶于乙醚。5.氨基酸一般有味（二）氨基酸的兩性性質和等電點1.氨基酸的兼性離子形式

氨基酸的兩個重要性質：氨基酸晶體的熔點高（200C）；氨基酸使水的介電常數增高。2.氨基酸的兩性解離在不同的pH條件下，兩性離子的狀態也隨之發生變化。PH1710凈電荷+10-1

正離子兩性離子負離子

等電點(PI)K′1、K′2分別代表α-COOH和α-NH3+的表觀解離常數，若側鏈R基有可解離的基團，其表觀解離常數用K′R表示。

丙氨酸的滴定曲線：

丙氨酸的滴定曲線當1mol/L的丙氨酸溶于水時，溶液的pH約為6，此時丙氨酸為兩性離子狀態Ala物質的表觀解離常數可以用測定滴定曲線的實驗方法求得。氨基酸的等電點（isoeletricpoint）及其計算氨基酸的等電點：當溶液pH為某一值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態。氨基酸等電點的計算：側鏈不含解離基團的中性氨基酸，其等電點是它的pK’1和pK’2的算術平均值：pI=(pK’1+pK’2)/2

同樣，對于側鏈含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊的pK’值的算術平均值。酸性氨基酸：pI=(pK’1+pK’R-COO-)/2堿性氨基酸：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2谷氨酸的解離及等電點計算賴氨酸的解離及等電點計算3.氨基酸的甲醛滴定

小結1.某氨基酸的等電點即為該氨基酸兩（兼）性離子兩邊的pK值和的一半。2.在氨基酸等電點以上任何pH，氨基酸帶凈的負電荷，在電場中向正極移動；在氨基酸等電點以下任何pH，氨基酸帶凈的正電荷，在電場中向負極移動。3.在一定pH范圍中，氨基酸溶液的pH離等電點愈遠，氨基酸攜帶的凈電荷愈大。（三）氨基酸的化學反應

亞硝酸反應烴基化反應酰化反應脫氨基反應西佛堿反應成鹽成酯反應成酰氯反應脫羧基反應疊氮反應側鏈反應用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。茚三酮水合茚三酮NH3+弱酸紫色化合物（570nm）

（1）與茚三酮反應1α-氨基與α-羧基共同參加的反應脯氨酸與茚三酮反應的產物：亮黃色化合物（440nm）用途：是多肽和蛋白質生物合成的基本反應。（2）成肽反應（1）亞硝酸反應這是范斯來克（VanSlyke）法測定氨基氮的基礎2α-氨基參與的反應（2）與芐氧酰氯反應（酰基化反應）酰化試劑在多肽和蛋白質的人工合成中被用作氨基的保護試劑。用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸.DNS+

AA多肽蛋白弱堿DNS-AA多肽蛋白酸DNS-AA+游離AA（乙醚抽提，有熒光）與丹磺酰氯反應（酰基化反應）

AADNFB+多肽蛋白用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸.亦稱Sanger反應弱堿DNP-AADNP-多肽DNP-蛋白+HF酸解DNP-AA（黃色、有機相）+游離AA（水相）與2、4-二硝基氟苯反應（烴基化反應）（黃色）

用途：可以用來鑒定多肽或蛋白質NH2末端氨基酸.亦稱Edman反應弱堿

AAPITC+多肽蛋白

AAPTC—多肽蛋白無水甲酸或HFPTH-AA+少一個AA的多肽或蛋白與苯異硫氰酸酯反應（烴基化反應）無色（4）形成西佛堿反應（5）脫氨基反應3、α-羧基參與的反應用途：這是羧基活化的一個重要反應，常用于肽的人工合成疊氮反應蛋白質的化學修飾：是指在較溫和的條件下，以可控制的方式使蛋白質與某種試劑（稱化學修飾劑）起特異反應，以引起蛋白質中個別氨基酸側鏈或功能團發生共價化學改變。

4．側鏈基團的化學性質(1)巰基（-SH）的性質作用：這些反應可用于巰基的保護。ICH2COOH巰基（-SH）的性質作用：該反應可用于增加胰蛋白酶水解位點和巰基的保護。巰基（-SH）的性質作用：與金屬離子的螯合性質可用于體內解毒。也是蛋白質結晶學中制備重原子衍生物最常用的方法對羥汞苯甲酸巰基（-SH）的性質作用：可用于比色法定量測定半胱氨酸的含量。二硫硝基苯甲酸(DTNB)

Ellman反應硫硝基苯甲酸在pH8.0時，412nm波長有強烈吸收巰基（-SH）的性質作用：氧化還原反應可使蛋白質分子中二硫鍵形成或打開。胱氨酸R-SH代表巰基化合物，如巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇（DTT）等（2）酚基的性質酪氨酸的酚基與重氮化合物（如對氨基苯磺酸的重氮鹽）反應，生成橘黃色化合物，這就是Pauly反應。作用：可用于檢測酪氨酸。與重氮化合物（如對氨基苯磺酸的重氮鹽）反應呈棕紅色（3）咪唑基的性質（4）胍基的性質（坂口反應）作用：用于檢測精氨酸（5）吲哚基的性質色氨酸的吲哚基在溫和的條件下可被N-溴代琥珀酰氧化，此應可用于分光光度計法測定蛋白質中色氨酸的含量。四、氨基酸混合物的分析分離（一）分配層析法的一般原理

層析即色層分析也稱色譜，1903年最先由俄國植物學家提出。

所有層析系統通常由2個相組成，一個為固定相或靜相，一個為流動相或動相。混合物在層析系統中的分離決定于該混合物的組分在這兩相中的分配情況，一般用分配系數描述。當一種溶質在兩種給定的互不相溶的溶劑中分配時，在一定溫度下達到平衡后，溶質在兩相中的濃度比值為一常數，即分配系數（Kd）。層析系統中的靜相可以是固相、液相或固－液混合相（半液體）；動相可以是液相或氣相，它充滿于靜相的空隙中，并能流過靜相。利用層析法分離混合物，其先決條件是各種氨基成分的分配系數要有差異，哪怕是很小的差異。一般差異越大，越容易分開。（二）分配柱層析層析柱中的填充物（支持劑）是具有親水性的不溶物質，吸附著一層不會流動的水，作為固定相，沿固定相流過的與它不互溶的溶劑（洗脫劑）為流動相。當流動相在固定相中流動時，混合物中具有不同分配系數的各種成分沿柱以不同的速度向下移動，分部收集柱下端的洗出液，分別用茚三酮顯色定量。（三）紙層析濾紙纖維素上吸附水作為固定相，展層用的溶劑是流動相。將氨基酸混合物點在濾紙的一個角上（原點），然后在密閉的容器中用一個溶劑系統沿濾紙的一個方向進行展層。烘干濾紙后，旋轉90℃，再用另一個溶劑系統進行第二向展層。當用茚三酮溶液顯色時，得到一個雙相紙層析譜。

相對遷移率（Rf）：從原點至氨基酸停留點的距離與原點至溶劑前沿的距離之比。Rf值

雙向紙層析圖（四）薄層層析優點：分辨率高、樣品量少、層析速度快、可使用的支持劑多。步驟：把支持劑涂布在玻璃板上使成一個均勻的薄層，把要分析的樣品滴加在薄層的一端，然后用合適的溶