六、色譜柱和色譜系統的故障檢修每個HPLC使用者應該知道什么

2023/7/231

HPLC的組成泵進樣器/自動進樣器色譜柱檢測器數據系統/積分儀表所有這些部件可能出現故障而需要檢修。2023/7/232HPLC的組成2023/7/233色譜柱問題的類型

A.壓力

B.峰形

C.保留時間2023/7/234

A壓力問題色譜柱觀測潛在的問題壓力高堵塞濾頭色譜柱污染

堵塞填料2023/7/235查出原因糾正壓力有／無柱子時檢查壓力①去柱后②去柱前③去預柱………….許多壓力問題是由于系統或保護柱的阻塞如果柱壓高:①沖洗柱子:排除柱污染和填料堵塞包括：高分子量／被吸附化合物樣品或緩沖液中的沉淀物②反沖柱子－清潔阻塞的濾頭③更換濾頭2023/7/236ColumnCleaning柱子清洗用比你的流動相更強的溶劑沖洗為了增加強度選擇反相溶劑對于分析柱每種溶劑至少用25ml沖洗沒有緩沖鹽的流動相100%Methanol甲醇100%Acetonitrile乙腈75%Acetonitrile:25%Isopropanol75%乙腈：25％異丙醇100%Isopropanol異丙醇100%MethyleneChloride★二氯甲烷100%Hexane★

已烷當用已烷蔌二氯甲烷柱子時,必須先用異丙醇沖洗,然后再用你的反相流動相2023/7/237柱子清洗為了增加強度選用正相溶劑或：每種溶劑至少用50ml

50%甲醇:50%氯仿乙酸乙酯2023/7/238

怎樣更換濾頭柱進口濾頭戴手套不要讓底座干燥不要使柱身受熱,否則填料會噴出不要旋得太緊旋好尾端螺母旋好尾端螺頭2023/7/239

壓力問題的預防柱保護保護柱/預柱在線過濾器樣品預處理適當的柱沖洗過濾緩沖流動相2023/7/2310

壓力問題的預防:在線裝置MobilePhasePre-ColumnInjectorFilterGuardFromPump預柱進樣器濾頭Column從泵來的流動相保護柱

AnalyticalColumnFilterandGuardColumnActonSample分析柱濾頭和保護柱作用于樣品

Pre-ColumnActsonMobilePhase

預柱作用于流動相ToDetector

到檢測器2023/7/2311

壓力問題的預防:樣品制備溶劑/化學環境微粒/凝聚物的除去Filtersamples過濾樣品Centrifugation離心分離固相萃取薄層板生物膜2023/7/2312

B峰形問題

Splitpeaks裂峰

Peaktailing峰拖尾

Broadpeaks寬峰Poorefficiency低柱效許多峰形問題是結合在一起的-例如:展寬和拖尾或拖尾和保留時間增加2023/7/2313裂峰可能的原因:Columncontamination柱污染Partiallypluggedfrit部分阻塞濾片Columnvoid柱頭塌陷Injectionsolventeffects溶劑效應2023/7/2314裂峰

柱污染Column:StableBondSB-C8,4.6×250mm,5μmMobilePhase:60%25mMNa2HPO4,pH3.0:40%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCDetection:UV254nmSample:1.Pseudoephedrine2.APAP3.Unknown4.ChlorpheniramineInjection1峰3峰形較好Injection30峰3裂峰Injection1AfterColumnWashwith100%CAN經100%乙腈沖洗后峰3峰形極好2023/7/2315裂峰

溶劑化效應Column:StableBondSB-C8,4.6×250mm,5μmMobilePhase:82%H2O:18%ACNInjectionVolume:30μLSample:1.Caffeine咖啡因2.Salicylamide水楊酰胺A.InjectionSolventB.InjectionSolvent100%AcetonitrileMobilePhase峰形寬拖尾峰形尖銳對稱樣品溶劑盡可能與流動相匹配

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裂峰原因的確定復雜樣品的基質或分析許多樣品------柱污染或部分阻塞濾片

流動相pH>=7------由于硅膠溶解使柱塌陷(除非使用專門的柱子)

--------預柱與柱的塌陷樣品的量大------裂峰和寬峰,由樣品量來決定

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峰拖尾、變寬和柱效降低可能的原因

柱“次級效應”（硅醇基效應）柱塌陷柱污染柱老化柱負荷超載柱外效應2023/7/2318

峰拖尾柱“次級效應”（掃尾劑）Column:Alkyl-C8,4.6×150mm,5μmMobilePhase:85%25mMNa2HPO4,pH7.0:15%ACNFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCSample:

1.Phenylpropanolamine苯丙醇胺／去甲麻黃堿2.Ephedrine麻黃堿3.Amphetamine安非他明／苯丙胺4.Methamphetamine脫氧麻黃堿5.Phenteramine苯三胺NoTEA無三乙胺10mMTEA10mM三乙胺USPTF(5%)美國藥典拖尾因子USPTF(5%)美國藥典拖尾因子1.1.291.1.192.1.912.1.183.1.633.1.204.2.354.1.265.1.575.1.14用流動相減尾劑(三乙胺)在pH7消除峰拖尾2023/7/2319峰拖尾柱“次級效應”（PH值）Column:Alkyl-C8,4.6×150mm,5μmMobilePhase:85%25mMNa2HPO4,pH7.0:15%ACNFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCSample:1.Phenylpropanolamine苯丙醇胺／去甲麻黃堿2.Ephedrine麻黃堿3.Amphetamine安非他明／苯丙胺4.Methamphetamine脫氧麻黃堿5.Phenteramine苯三胺

pH3.0pH7.0USPTF(5%)美國藥典拖尾因子USPTF(5%)美國藥典拖尾因子4.脫氧麻黃堿1.334.脫氧麻黃堿2.35降低流動相的pH,減小與硅醇基作用引起的峰拖尾2023/7/2320峰拖尾

柱污染Column:StableBondSB-C8,4.6×250mm,5μmMobilePhase:20%H2O:80%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:R.T.Detection:UV254nmSample:1.Uracil尿嘧啶2.Phenol苯酚3.4-Chloronitrobenzene4-氯硝基苯4.Toluene甲苯PlatesTFPlatesTFPlatesTF理論板數拖尾因子理論板數拖尾因子理論板數拖尾因子1.76292.081.79061.431.74481.062.120431.642.124431.212.122371.213.137271.693.179991.193.153661.114.133551.324.170981.254.190671.17QCtestforwarddirectionQCtestreversedirectionQCtestaftercleaning100%IPA,35oC

向前方向相反方向

100%異丙醇沖洗后2023/7/2321

峰拖尾/變寬樣品過載效應Column:4.6×150mm,5μmMobilePhase:40%25mMNa2HPO4,pH7.0:60%ACNFlowRate:1.5mL/minTemperature:40oCSample:1.Desipramine去郁敏/脫甲基丙米嗪

2.Nortriptyline

3.Doxepin4.Imipramine丙米嗪5.Amitriptyline阿米替林6.Trimipramine2023/7/2322峰拖尾/變寬樣品過載效應USPTF拖尾因子Plates理論板數HighLoad/10LowLoadHighLoad/10LowLoad高載負/10倍低載負高載負/10倍低載負1.1.601.7085059412.2.001.9081578423.1.561.56277662314.2.131.70253983595.2.151.862735100226.1.251.255189107252023/7/2323

峰變寬,裂開

柱塌陷（pH）MobilePhase:流動相：50%CAN:50%Water:0.2%TEA(~pH11)50％乙腈:50％水:0。2％三乙胺(~pH11)

After30injectionsInitial開始時

進樣30次后多數峰形改變可能是同一柱問題引起的。在這個例子中，高pH溶解硅膠導致塌陷2023/7/2324峰變寬,裂開

柱塌陷（遲到的峰）Column:Extend-C18,4.6×150mm,5μmMobilePhase:40%10mMTEA,pH11:60%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:R.T.Detection:UV254Sample:1.Maleat順丁烯二酸2.Pseudeophedrine偽麻黃堿3.Chlorphenniramine氯非尼拉明理論板數極低的理論板數表明這是一個前面進樣極遲洗脫出來的峰2023/7/2325峰拖尾

進樣器密封性差Column:Bonus-RP,4.6×75mm,3.5μmMobilePhase:30%H2O:70%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:R.T.Detection:UV254nmSample:1.Uracil尿嘧啶2.Phenol苯酚3.N,N-DimethylanilineN,N-二甲苯胺PlatesTFPlatesTF理論板數拖尾因子理論板數拖尾因子1.22351.721.36701.452.34911.482.104571.093.54321.15