3.2基因工程的基本操作程序DNA合成儀顯微注射技術(shù)從社會(huì)中來

1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。

你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程：提取棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)3.2基因工程的基本操作程序（四個(gè)步驟）目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性。使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，才能實(shí)現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。前提核心關(guān)鍵保證一、目的基因的篩選與獲取1.目的基因：主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2.實(shí)例：3.基因結(jié)構(gòu)：與生物抗逆性相關(guān)的基因（Bt抗蟲基因）與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因（胰島素、干擾素基因）與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)原核生物基因終止子：終止轉(zhuǎn)錄補(bǔ)充知識(shí)：基因結(jié)構(gòu)：非編碼區(qū)組成：編碼區(qū)上游與編碼區(qū)下游功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)啟動(dòng)子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始的信號(hào)終止子：終止RNA的合成編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成加工轉(zhuǎn)錄mRNA前體成熟mRNA真核細(xì)胞的基因非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外顯子內(nèi)含子12345啟動(dòng)子終止子補(bǔ)充知識(shí)：基因結(jié)構(gòu)：原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼注意1、非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子2、編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？思考從生物細(xì)胞中直接獲取人工合成5.目的基因獲取方法：4．目的基因的來源：（一）從基因文庫(kù)中獲取；（二）通過DNA合成儀直接合成（三）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增；一、目的基因的篩選與獲取反轉(zhuǎn)錄法據(jù)已知的氨基酸序列推測(cè)合成DNA通過DNA合成儀合成（一）從基因文庫(kù)中獲取目的基因1.基因文庫(kù)概念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。2.基因文庫(kù)類型：（未知序列）基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（包含一種生物的所有基因）（cDNA文庫(kù)）（包含一種生物的一部分基因）提取某種生物的全部DNA一定大小的DNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袑NA片段與載體連接基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式圖3.成熟mRNA成熟mRNAcDNA文庫(kù)成熟mRNA部分基因文庫(kù)構(gòu)建模式圖4.5.基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的構(gòu)建過程比較cDNA文庫(kù)以原核生物為主真核生物人工合成鳥槍法基因組DNA文庫(kù)cDNA文庫(kù)6.基因文庫(kù)的構(gòu)建過程某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運(yùn)載體連接導(dǎo)入基因組文庫(kù)某種生物某個(gè)時(shí)期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運(yùn)載體連接導(dǎo)入部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）7.基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)基因組文庫(kù)文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。

如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性8、從基因文庫(kù)中得到目的基因的方法目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成（二）人工合成目的基因1．反轉(zhuǎn)錄法：2.根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成3、人工合成法DNA合成儀1、前提：基因比較小、核苷酸序列已知（序列已知）2、方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因哪些新技術(shù)能大大簡(jiǎn)化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀：2）PCR技術(shù)：

對(duì)提取出來的基因進(jìn)行核苷酸序列分析

使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增。（三）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。1、概念：表3-1DNA復(fù)制所需的基本條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶（體外用高溫代替）打開DNA雙鏈DNA兩條母鏈提供DNA復(fù)制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈與兩條母鏈結(jié)合的2種引物使DNA聚合酶能夠從引物3′端連接脫氧核苷酸3、方式：2、條件以指數(shù)方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）2n4、PCR過程：變性、復(fù)性、延伸三步曲變性：90～95℃復(fù)性：55～60℃延伸：70～75℃變性復(fù)性延伸變性

（90--95℃）復(fù)性延伸5555（55--60℃）（70--75℃）5、PCR的一輪擴(kuò)增1.變性：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2.復(fù)性：引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合；3.延伸：合成鏈在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸。變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成_________b、復(fù)性（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈6、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：ATCGAATCGGTT

UACCTTAGCCAADNA聚合酶母鏈DNA子鏈DNA引物3′3′5′5′知識(shí)回顧---DNA復(fù)制過程高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化2）TaqDNA聚合酶的應(yīng)用DNA模板，四種脫氧核苷酸，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，Taq酶4)PCR和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn)PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長(zhǎng)度通常為20－30個(gè)脫氧核苷酸1）DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只有當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶才能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸7、關(guān)于PCR的幾點(diǎn)說明：3)緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)模板DNA利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：50℃引物1引物2DNA引物95℃利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：72℃第1輪結(jié)束第2輪開始利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：72℃第2輪結(jié)束利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因過程：循環(huán)次數(shù)DNA數(shù)量122438201,048,576301,073,741,82430次循環(huán)后靶序列擴(kuò)增的數(shù)量8、PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子從基因文庫(kù)中尋找聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增化學(xué)合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知小結(jié)：獲取目的基因的常用方法有哪些?初始目的基因的來源1.從生物中直接獲取2.人工合成注意：要保持基因的完整性二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心1、目的：2）使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。2、組成：a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。注意：②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少。④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。思考1：表達(dá)載體為什么一定要有啟動(dòng)子？生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能有利于基因的表達(dá)；（2）通過cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體細(xì)胞無法轉(zhuǎn)錄。位于基因首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。1、啟動(dòng)子：操縱基因結(jié)構(gòu)基因

啟動(dòng)子RNA聚合酶是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來。思考3：標(biāo)記基因有什么作用？思考2：終止子的作用是什么？

終止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程兩個(gè)切口獲得目的基因質(zhì)粒DNA分子限制酶處理DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端?思考?用DNA連接酶處理后會(huì)出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)如何避免質(zhì)粒的自我環(huán)化和目的基因反向連接的問題？（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌②轉(zhuǎn)化過程:具有趨化性（酚）基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物（3）花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞方法：顯微注射法提純含目的基因表達(dá)載體受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物（2）操作:顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞（1）微生物作受體細(xì)胞原因：（2）常用法：Ca2+處理常用菌：大腸桿菌（增加細(xì)胞壁的透性，與細(xì)胞膜無關(guān)）（3）過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA繁殖快，多為單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。受體生物植物動(dòng)物微生物受體細(xì)胞導(dǎo)入方法受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞小結(jié)：