第十一章經典液相色譜法第1頁，課件共48頁，創作于2023年2月液相色譜法（LC）：以液體為流動相的色譜法回顧液相色譜柱色譜法平面色譜法紙色譜法薄層色譜法第2頁，課件共48頁，創作于2023年2月一、吸附色譜法1.要求：

固定相→吸附劑（硅膠或Al2O3）具表面活性吸附中心2.分離機制：利用吸附劑對不同組分的吸附能力差異而實現分離吸附系數注：Ka與組分的性質、吸附劑的活性、流動相的性質及溫度有關

吸附平衡

Xm+nYa→Xa+nYm

第一節基本原理與分類（一）分離原理第3頁，課件共48頁，創作于2023年2月一、吸附色譜法3.流動相的洗脫能力:與溶劑極性有關溶劑極性越強，洗脫能力越強→組分ka越小→柱色譜：tR越短→組分越快流出平面色譜：Rf越大→展開越快（展距越長）

4.洗脫順序

色譜柱一定，Ka大，即極性越強的組分吸附力越強→→→

柱色譜：tR越長→洗脫慢；反之Ka小，極性越弱組分先被洗脫。平面色譜：Rf越小→展開慢；反之Ka小，極性越弱組分展開快。第4頁，課件共48頁，創作于2023年2月附：常見化合物極性①見登山圖1②雙鍵↑，吸附力↑③分子內氫鍵，吸附力↓二甲胺酯酮酰胺醛硫醇胺類醇酚羧酸硝基化合物醚烯烴烷烴取代基極性登山圖1第5頁，課件共48頁，創作于2023年2月附：常見溶劑極性石油醚環已烷四氯化碳苯甲苯乙醚氯仿醋酸乙酯正丁醇丙醇乙醇、甲醇水流動相極性登山圖2乙腈第6頁，課件共48頁，創作于2023年2月（二）固定相-吸附劑常用吸附劑

1.硅膠

2.氧化鋁

3.聚酰胺第7頁，課件共48頁，創作于2023年2月1.硅膠（SiO2·xH2O）----極性吸附劑,弱酸性結構：內部——硅氧交聯結構→多孔結構表面——有硅醇基→氫鍵作用→吸附活性中心1）與極性物質或不飽和化合物形成氫鍵

物質極性↑，吸附能力↑→不易展開，K大，Rf越小

吸附活性次序：束縛型＜游離型

硅醚無活性

2）含水量越大，活性越低，吸附能力越低

加熱失水—活化:

105～110OC

(30分鐘)----(可逆失水)

200OC------(不可逆失水)→活性喪失適用：分析酸性或中性物質，如有機酸、氨基酸、甾體等選擇性保留堿性物質,如胺類硅醚第8頁，課件共48頁，創作于2023年2月2.

氧化鋁—強極性吸附劑(一般得拖尾峰)

堿性氧化鋁pH9～10適于分析堿性、中性物質中性氧化鋁pH≈7.5適于分析酸性堿性和中性物質酸性氧化鋁pH4～5適于分析酸性、中性物質3.聚酰胺

氫鍵作用氫鍵能力↑強，組分展開越慢應用：分離酚、酸、硝基、醌類如：黃酮類化合物活化溫度:200~400℃(0.5h)應用：分離生物堿、揮發油、萜類、甾體、甙、酯、內酯等第9頁，課件共48頁，創作于2023年2月硅膠含水量%氧化鋁含水量%活性級別吸附活性(能力)051525380361015ⅠⅡⅢⅣⅤ大(強)↓↓↓小(弱)4.吸附劑的活性吸附劑含水量越高，吸附活性越低，吸附能力越弱，活性級數越大，同一組分和流動相，其K越小

加熱失水—活化加水—減活或失活分離極性小的組分—選吸附活性大的吸附劑分離極性大的組分—選吸附活性小的吸附劑第10頁，課件共48頁，創作于2023年2月1.分離機制

利用組分在流動相和固定相間溶解度差別實現分離

狹義分配系數二、分配色譜法液液分配色譜（LLC）：K與流動相的性質（極性及種類）有關

氣液分配色譜（GLC）：K與固定相極性和柱溫有關第11頁，課件共48頁，創作于2023年2月1）要求：

固定相—固定液機械涂漬在惰性載體上的液體（易流失）

化學反應鍵合在載體表面—化學鍵合相

流動相→必須與固定相不為互溶（LLC）

載體→惰性，性質穩定

不與固定相和流動相發生化學反應2.固定相和流動相2）液液分配色譜的類別：

正相分配色譜→固定相極性大于流動相反相分配色譜→固定相極性小于流動相

正相分配色譜:極性弱的組分先被洗脫反相分配色譜:極性強的組分先被洗脫3)洗脫順序：極性相似相溶第12頁，課件共48頁，創作于2023年2月洗脫順序極性大的組分，K小→tR短，先出柱

正相液—液分配色譜

反相液—液分配色譜固定相強極性溶劑:水、醇類等弱極性溶劑:辛烷、氯仿等流動相強極性化合物弱極性至非極性物質極性小的組分，K小→tR短，先出柱分離對象弱極性溶劑:苯、甲苯、環己烷等強極性溶劑:緩沖溶液、醇類等第13頁，課件共48頁，創作于2023年2月化學鍵合相：

將固定液的官能團鍵合在載體的表面，而構成鍵合相。

以化學鍵合相為固定相的色譜法稱為化學鍵合相色譜法。化學鍵合相既有分配作用又有吸附作用※正相鍵合相色譜法如氰基與氨基化學鍵合相流動相用烷烴，加適量極性調整劑而構成※反相化學鍵合相如十八烷基鍵合相流動相常用甲醇—水或乙腈—水第14頁，課件共48頁，創作于2023年2月三、離子交換色譜法1.分離機制：依據被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同選擇性系數

注：KA/B越大，A離子交換能力越大，越易保留，tR越長

以陽離子交換樹脂為例

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

固定離子可交換離子B待測離子A通式：R-B+A→R-A+B第15頁，課件共48頁，創作于2023年2月3.影響保留行為的因素：KA/B與離子的電荷數、水合離子半徑、流動相性質、離子交換樹脂性質以及溫度有關

1）離子價態越高→Ka越大→tR越長

2）價態相同，水合離子半徑越小，Ka越大→tR越長

3）交換能力強的離子組成的流動相洗脫能力強→tR越短

4）離子強度大的流動相洗脫能力強→tR越短2.固定相→離子交換劑經典離子交換色譜：離子交換樹脂

HPLC：化學鍵合離子交換劑

流動相→水為溶劑的緩沖溶液第16頁，課件共48頁，創作于2023年2月四、分子（空間）排阻色譜法要求：

固定相→多孔性凝膠—凝膠色譜

流動相→水——凝膠過濾色譜(GFC)

流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜(GPC)

分離機制：根據被測組分分子大小的不同分離—分子篩原理滲透系數Kp

注：Kp僅取決于待測分子尺寸和凝膠孔徑大小，與流動相的性質無關

Kp=0：尺寸太大全被排阻Kp=1：尺寸太小全被保留

0＜Kp＜1第17頁，課件共48頁，創作于2023年2月空間排阻色譜法的分類：1、凝膠滲透色譜法GPC：

分離親脂性物質固定相:親脂性凝膠如甲基交聯葡聚糖凝膠流動相:有機溶劑2、凝膠過濾色譜法GFC：

分離水溶性物質固定相:親水性凝膠如葡聚糖凝膠流動相:水第18頁，課件共48頁，創作于2023年2月分離對象：大分子量（＞2000）的化合物

有機聚合物（如聚烯烴、聚苯乙烯和聚酰胺等）生物大分子（如蛋白質、核酸、低聚糖、肽類等）局限：不能分離大小相近的化合物為得到良好的分離，組分的分子量應相差10%以上。應用Kp∝尺寸∝相對分子質量——

可應用于高分子分子量的測定第19頁，課件共48頁，創作于2023年2月

結論：四種色譜的分離機制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡

K分別為吸附系數，狹義分配系數，選擇性系數和滲透系數除了凝膠色譜法中的K僅與待測分子大小尺寸、凝膠孔徑大小有關外，其他三種K值都受組分的性質、流動相的性質、固定相的性質以及柱溫的影響第20頁，課件共48頁，創作于2023年2月第三節平面色譜法分類：平面色譜薄層色譜(TLC)紙色譜（PC）薄層電泳法吸附薄層色譜分配薄層色譜分子排阻薄層色譜P236第21頁，課件共48頁，創作于2023年2月一、平面色譜參數（一）定性參數

1、比移值（Rf）

Rf=0:組分在原點，完全被固定相保留

Rf=1:

組分在前沿，完全不被固定相保留

最佳范圍：0.3-0.5

可用范圍：0.2-0.8LALBL0第22頁，課件共48頁，創作于2023年2月討論

1）Rf與K有關，即與組分性質（溶解度）以及薄層板和展開劑的性質有關

2）K↑大，Rf↓小

3）薄層板一定，對于極性組分展開劑極性↑大，Rf↑大（容易展開）展開劑極性↓小，Rf↓?。ú蝗菀渍归_）☆色譜條件一定，Rf只與組分性質有關——

薄層色譜定性參數☆Rf值與組分性質、薄層板性質、展開劑性質、展開室內展開劑蒸氣飽和程度、溫度等有關第23頁，課件共48頁，創作于2023年2月續前2.相對比移值Rst

討論參考物與被測組分在完全相同條件下展開

可以消除系統誤差，大大提高重現性和可靠性；參考物可以是后加入純物質，也可是樣品中已知組分相對比移值Rst與組分、參考物性質及色譜條件有關，范圍可以大于或小于1第24頁，課件共48頁，創作于2023年2月定義式：R=2d/（W1+W2）=2(L2-L1)/（W1+W2）W1,W2：各斑點直徑完全分離：R≥1.5基本分離：R＝1.0最佳分離：R=2.0（二）分離度薄層掃描圖dW1W2L0第25頁，課件共48頁，創作于2023年2月

柱色譜

平面色譜屬性定距洗脫定時展開流動相名稱保留時間tR

比移值Rf(展開距離)

定性參數洗脫劑展開劑K越小→tR

越短洗脫越快展開順序K越小→

Rf越大展開越快第26頁，課件共48頁，創作于2023年2月

二、薄層色譜法定義：將固定相均勻地涂鋪在具有光潔表面的玻璃、塑料或金屬上形成薄層，在此薄層上進行色譜分離的方法薄層板：鋪好固定相層的板特點：1、分離能力強，斑點集中；2、靈敏度高；

3、展開時間短；4、試樣預處理簡單；

5、上樣量大；6、儀器簡單操作方便第27頁，課件共48頁，創作于2023年2月（一）吸附薄層色譜法的吸附劑和展開劑常用吸附劑

1.硅膠

2.氧化鋁

3.聚酰胺二、薄層色譜法第28頁，課件共48頁，創作于2023年2月（二）展開劑的選擇（同液固吸附色譜流動相選擇）根據被測組分、吸附劑和展開劑本身的極性第29頁，課件共48頁，創作于2023年2月吸附劑和流動相的選擇：

依據被測組分、吸附劑和流動相的性質1.被測組分性質（極性大?。?/p>

烴＜

--------＜羧酸2.吸附劑的活性：

吸附劑的活性↑大，對組分的吸附能力↑強，K↑大

強極性物質——選擇弱吸附劑弱極性物質——選擇強吸附劑3.流動相的極性：

流動相極性↑大，對組分的展開能力↑大,K↑小

“相似相溶”原則：根據組分性質、吸附劑的活性，選擇適當極性的流動相第30頁，課件共48頁，創作于2023年2月4.三者關系圖示：

組分吸附劑流動相極性活性小極性非(弱)極性活性大非極性或弱極性5.展開順序:

固定相、展開劑一定

極性越小者Rf越大,展開快極性越大者Rf越小,展開慢6.吸附劑活性越大，Rf

展開劑極性越大，Rf第31頁，課件共48頁，創作于2023年2月例.硅膠板分離生物堿，展開劑為：環己烷:丙酮:乙二胺:水=10：5：2：51）環己烷：弱極性，減弱洗脫能力，增大K，減小Rf2）水：強極性，增強洗脫能力，減小K，增大Rf3）丙酮：中等極性，增加極性與弱極性溶劑間的互溶性4）乙二胺：調節pH值，抑制組分離解，減少斑點拖尾。第32頁，課件共48頁，創作于2023年2月（二）薄層色譜操作方法1）薄層板的類型（1）硬板：加粘合劑—濕法鋪板（2）軟板：無粘合劑—干法鋪板

1.薄層板的制備2）粘合薄層板（硬板、濕板）的鋪制⑴粘合劑煅石膏：吸附劑的9-15%左右—硅膠-G板羧甲基纖維素鈉CMC-Na：0.5-1%水溶液—硅膠-CMC板第33頁，課件共48頁，創作于2023年2月3）鋪板方法（1）傾注法鋪板（2）平鋪法鋪板（3）機械涂鋪法鋪板4）活化涼干-活化-放冷-干燥器中注意：活化溫度及時間（105℃，1h）活化的目的（除去水分）第34頁，課件共48頁，創作于2023年2月2.點樣1）樣品溶液

避免用水作溶劑，斑點易擴散，溶劑不易揮發一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發性溶劑最好用與展開劑極性相似的溶劑2）點樣量

幾到幾十微克，點樣直徑不超過2~3mm間距1.5~2cm端距1~2cm直徑:3mm。幾~幾十微克，少于10μL起始線第35頁，課件共48頁，創作于2023年2月3.

展開

(1)展開方式:上行展開法、近水平展開雙向展開、同向多次展開

軟板——近水平展開硬板——上行法(2)展開中注意之點

a)邊緣效應：同一物質在同一薄板上展開時兩邊的Rf值與中間部分的Rf值不同

b)消除邊緣效應的措施：展開前充分飽和15~30min

展開槽內壁貼上濾紙條浸濕選小體積展開槽第36頁，課件共48頁，創作于2023年2月圖示第37頁，課件共48頁，創作于2023年2月4.顯色顯色方法1、有色化合物——直接定位2、無色顯色劑：通用有碘、碘化鉍鉀、溴甲酚綠、硫酸例：分離酸性物質

選酸性硅膠板，使用溴甲酚綠為顯色劑紫外吸收紫外燈檢出斑點有熒光熒光板上有暗斑顯色劑定位噴霧顯色蒸氣顯色：碘-生物堿、氨基酸衍生物、肽類、脂類及皂苷噴霧后加熱顯色★第38頁，課件共48頁，創作于2023年2月1）Rf

定性（三）定性與定量分析1.定性分析⑴組分的結構和性質⑵薄層板的性質⑶展開劑的性質⑷溫度（對分配影響大，對吸附影響?。烧归_室內展開劑蒸氣飽和程度影響比移值的因素2）相對比移值Rst定性與對照品Rst比較或與文獻Rst比較。第39頁，課件共48頁，創作于2023年2月2.雜質檢查1）雜質對照品比較法：同一色譜條件下比較試樣與雜質對照品斑點的顏色深淺2）主成分自身對照法

供試品

稀釋對照液→對照斑點顏色

硫酸長春堿稀釋對照液→展開→紫外檢測

10mg/ml0.20mg/ml254nm第40頁，課件共48頁，創作于2023年2月3.定量分析1）洗脫法定量：薄層分離——取下斑點——洗脫——離心

——取上清液進行測定2）原位直接定量——薄層掃描法

第41頁，課件共48頁，創作于2023年2月1）薄層掃描法原理----樣品經TLC分離,按光學原理(吸收光、反射光、熒光等）進行定量分析

檢測原理熒光法透射法反射法

反射法測定：重現性好，基線穩定。

薄層掃描法定義：用一定波長、強度的光束照射薄層上的斑點，測量照射前后光束強度的變化來測定物質含量第42頁，課件共48頁，創作于2023年2月2）光譜掃描曲線：A-

或F-ex-em用途：對斑點成分作定性分析為定量分析找出測量sSA第43頁，課件共48頁，創作于2023年2月3）色譜掃描曲線在一定的波長下，可找出斑點的位置，即A-L(Rf)的關系起始線LA（1）單波長（s）掃描法（2）雙波長（R，

s）掃描法：得△A，可消除本底干擾，基線穩定4）掃描方式：直線式：快。用于規則的圓斑鋸齒式：慢。用于不規則的或規則的斑點定量定性分析及熒光定量分析一律用直線式

測定波長λs及參比波長λR的選擇λs：被測組分的最大吸收波長λR：不被被測組分所吸收的波長—薄層板的空白吸收第44頁，課件共48頁，創作于2023年2月練習例1.硅膠柱分離羧酸，哪種溶劑t