第三章薄層色譜法基礎第1頁，課件共52頁，創作于2023年2月目錄

一前言二基本參數三薄層層析的操作四特殊的薄層五應用舉例第2頁，課件共52頁，創作于2023年2月薄層色譜法通常指以吸附劑為固定相的一種液相色譜法。即將固定相在玻璃、金屬或塑料等光潔的表面上均勻地鋪成薄層，試樣點在薄層的一端，流動相借毛細作用流經固定相,使被分離的物質展開。一.前言定義:常用的薄層色譜法以吸附劑為固定相,屬于吸附色譜的范疇繼柱色譜和紙色譜之后發展起來的方法第3頁，課件共52頁，創作于2023年2月薄層色譜與液相色譜法比較

HPLCTLC每次只能分析一個樣品在一塊板上點上多個樣品同時進行分離對樣品制備要求高，必須不含可吸留在柱上的雜質，否則柱性能受損用畢一次棄去，可直接用樣品的粗提物點樣可用檢測器種類較少展開后可用多種手段檢測特點第4頁，課件共52頁，創作于2023年2月薄層色譜與柱層析和紙層析比較

(1)快速(數十秒~數十分鐘)(2)分離效率高(多柱路)(3)靈敏度高

(斑點擴散小,比紙色譜高10-100倍)(4)顯色方法多樣(腐蝕性顯色劑)(5)圖象易保存第5頁，課件共52頁，創作于2023年2月比移值（Rf）

Rf=原點至組分點中心的距離/原點至流動前沿的距離組分A的Rf=a/c

組分B的Rf=b/c相對比移值，即相對于某一物質x的Rf值，用Rx表示。其定義為：Rx＝組分的Rf值／物質x的Rf值組分A相對于物質B的“相對比移值”RB=a/b二.基本參數第6頁，課件共52頁，創作于2023年2月三.薄層色譜的操作

吸附劑的選擇薄層板的制作展開劑的選擇點樣展開定位與顯色

薄層層析的定量測定第7頁，課件共52頁，創作于2023年2月(一)薄層層析用的吸附劑常用的薄層層析吸附劑有硅膠、氧化鋁、纖維素、聚酰胺等。吸附劑的選擇：首先決定于樣品成分的性質，即它們的溶解性、酸堿性、極性以及是否與吸附劑起化學反應等；其次要考慮吸附劑、載體是否容易得到及其價格等。第8頁，課件共52頁，創作于2023年2月第9頁，課件共52頁，創作于2023年2月層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（紙漿、纖維素、硅膠、中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化鍵合硅膠等）均勻地涂在在薄層板（玻璃板、金屬板或彈性塑料板）上，干燥（110℃活化）后即可使用。(二)薄層板的制作第10頁，課件共52頁，創作于2023年2月1）洗板第11頁，課件共52頁，創作于2023年2月2）攪拌第12頁，課件共52頁，創作于2023年2月3）涂板 第13頁，課件共52頁，創作于2023年2月4）晾干第14頁，課件共52頁，創作于2023年2月(三)薄層層析中展開劑的選擇

主要根據極性的不同來選擇流動相展開劑。各種展開劑按其極性不同排序為：烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸第15頁，課件共52頁，創作于2023年2月選擇薄層條件的簡圖

圖2化合物的極性、吸附劑的活度及展開劑極性間的關系

Stahl設計的用以選擇薄層條件的簡圖（1）為被分離化合物的極性（2）為吸附劑的活度（3）為展開劑的極性。若將這三個因素各自固定在圓周的三分之一，轉動圓盤正中的三角形，如果角A指向極性物質，則角B指向活度小的吸附劑，角C就指向選用極性展開劑；如轉到A’，B’，C’處則又要作另外的選擇組合。第16頁，課件共52頁，創作于2023年2月

極性較大的溶劑可以使化合物在薄層上移動。極性較小的溶劑降低極性大的溶劑的洗脫能力，使Rf值降低。中等極性的溶劑往往起著使極性相差較大溶劑混合均勻的作用。在展開劑中加入少量酸、堿可以使某些極性物質斑點集中，提高分離度。用粘度太大的溶劑時需要加入一種溶劑以降低展開劑的粘度，加快展開速度。例如環己烷-丙酮-二乙胺-水（10:5:2:5）這個系統中，水是極性大的溶劑，環己烷是極性小的溶劑，后者的加入可以降低分離物質的Rf值，丙酮起著混勻整個系統及降低展開劑粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展開劑的pH值以使分離后的斑點不致拖尾，分離清晰。多元展開劑中各種溶劑的作用第17頁，課件共52頁，創作于2023年2月

在具體工作中，展開劑的選擇還必須進一步通過實踐，一般可用下列三種方法：

(1)查閱文獻

(2)微型薄層：用小玻片鋪上薄層，用各種經初步選擇認為可能應用的展開劑展開，從而選擇適當的展開劑，再用于一般的薄層層析。用微型薄層，節省材料和時間。

(3)微量圓環技術第18頁，課件共52頁，創作于2023年2月

將試樣溶液點于已準備好的薄層上，點成同樣大小的圓點，用毛細管吸取各種經初步選擇認為可能應用的展開劑，加到試樣點中心，讓展開劑自毛細管中慢慢流出進行展開。

微量圓環技術

1用環己烷展開

2用苯展開

3用氯仿展開微量圓環技術

第19頁，課件共52頁，創作于2023年2月(四)點樣1.樣品溶液一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等揮發性有機溶劑，最好用與展開劑極性相似的溶劑溶解試樣，配成0.5%~1%的試液。2.點樣量點樣量的多少與薄層的性能、厚薄及顯色劑的靈敏度有關。一般來說，樣品量最小為幾ng，常用量為幾至幾十μg，制備型的分離可以點樣到mg量。總之點樣量隨分離目的而定。3.點樣方式最好是直徑3—5mm的圓點。第20頁，課件共52頁，創作于2023年2月常用的點樣方式

a一般點樣b徑向點樣c條狀點樣d線形小孔點樣e樣品填入溝槽第21頁，課件共52頁，創作于2023年2月

徑向展開與普通展開的區別第22頁，課件共52頁，創作于2023年2月4.點樣容器

定容毛細管微量注射器點樣器第23頁，課件共52頁，創作于2023年2月(五)展開1.水蒸氣的影響2.溶劑蒸氣的影響3.展開槽4.展開方式5.幾種新型的展開技術6.展開操作第24頁，課件共52頁，創作于2023年2月1.水蒸氣的影響

在吸附薄層色譜的展開過程中，空氣的相對濕度以及展開槽中的水蒸氣必須嚴格控制，微量的水也能對色譜分離結果產生較大的影響。硅膠薄層板吸附水蒸氣的速度很快，0.25mm厚、20×20cm的薄層板在50%相對濕度中約3分鐘就失去活性的一半，而15分鐘時吸附的水分已達到最大值，因此，點樣速度的快慢，空氣相對濕度的大小，都可以影響分離以及重現性。適宜的相對濕度范圍也決定于溶質和溶劑的極性。第25頁，課件共52頁，創作于2023年2月2.溶劑蒸氣的影響

“邊緣效應”：Stahl在用氯仿-甲醇（95：5）為展開劑展開麥角生物堿時發現，對同一種生物堿，在薄層板中部的Rf值比在邊緣的Rf值小，稱此現象為“邊緣效應”（edgeeffect）。展開槽中被展開劑蒸氣飽和后再進行展開就可以消除。圖5在未飽和展開槽中薄層板上出現的“邊緣效應”第26頁，課件共52頁，創作于2023年2月3.展開槽

普通展開槽雙底展開槽水平展開槽第27頁，課件共52頁，創作于2023年2月4.展開方式(1)近水平展開：將點樣后的薄層板下端浸入展開劑0.5cm，薄層上端墊高使薄層與水平成5-10o的角。(2)上行展開：將點樣后的薄層放在盛有展開劑的直立型的展開槽中，展開劑由薄層下端借毛細管作用上升至前沿。(3)下行展開(4)雙向展開第28頁，課件共52頁，創作于2023年2月薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開劑層析缸展開劑濾紙條下行法薄層板第29頁，課件共52頁，創作于2023年2月幾種新型的展開技術(1)程序蒸氣展開（Vapor-programmed，VP）(2)圓形色譜（RadialChromatography）(3)熱板色譜(HotplatesChromatography)(4)多次展開（MultipleDevelopment）(5)程序多次展開（programmedMultipleDevelopment，PMD）(6)階式展開（stepwisedevelopment）(7)梯度展開（gradientdevelopment）第30頁，課件共52頁，創作于2023年2月6展開操作1.展開槽的密閉目的是使展開槽被展開劑蒸氣飽和并使展開劑組成不變。2.展開槽的飽和為避免“邊緣效應”，在薄層板用展開劑蒸氣飽和有時是必要的。3.展開距離常規薄層最長展距為20cm;高效薄層展距最長為10cm。4.展開溫度第31頁，課件共52頁，創作于2023年2月展距對結果的影響，硅膠HPTLC分離洋甘菊油，

a）3cm、b）5cm、c）7cm、d）9cm。展距對結果的影響第32頁，課件共52頁，創作于2023年2月(六)薄層層析的定性檢測

展開完畢后，把薄層從層析缸中取出，用鉛筆劃出或小針刺出展開劑前緣的位置，隨即進行顯色，以確定各個斑點的位置、Rf值和顯色情況，從而判斷試樣中含有哪些組分。有色物質經展開后呈現明顯的色斑，很易判斷。對于無色物質，可根據化合物的性質，用物理檢出法、化學檢出法、酶與生物檢出法和放射性檢出法進行顯色。

第33頁，課件共52頁，創作于2023年2月1物理檢出法

1.紫外光一般來說，對于未知化合物，展開后在用顯色劑以前，都應先在紫外燈下進行察看。紫外光常用兩種波254nm與365nm。如果化合物能吸收紫外光同時放出熒光，可用此熒光定位。

2.碘元素碘的最大特點是與物質的反應往往是可逆的，當化合物定位以后在空氣中放置時，碘即升華揮去，可以回到組分的原來狀態，有利于薄層的進一步處理。

3.水水可作為一種非破壞性顯色劑，用于硅膠薄層，當許多憎水性化合物展開后，用水噴薄層板，對光觀察，在半透明的薄層板上，顯出白色不透明的斑點。第34頁，課件共52頁，創作于2023年2月2.化學檢出法

化學檢出法是在薄層上使用一種或數種化學試劑與被檢出物質反應，生成有顏色的化合物而定位。這種試劑叫顯色劑。顯色劑一般分為兩類，即通用顯色劑和專屬性顯色劑。第35頁，課件共52頁，創作于2023年2月1通用顯色劑

(1)濃硫酸或50%的硫酸溶液：極大多數有機物質，噴此種顯色劑后立刻或在加熱到110—120℃并經數分鐘后出現棕色到黑色斑點。

(2)酸堿指示劑溶液：例如0.3%溴甲酚綠甲醇溶液，在綠色背景上顯現黃色斑，表示是脂肪族羧酸。常用的通用顯色劑還有：5%磷鉬酸乙醇、堿性高錳酸鉀溶液、硝酸銀-氫氧化銨試劑、熒光顯色劑等。

2專屬性顯色劑

指能使某一類或少數幾類官能團或化合物顯色的試劑。例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液噴后在120℃加熱10分鐘，醛酮在黃橙色背景上顯紅色或橙色斑。第36頁，課件共52頁，創作于2023年2月3原位化學衍生化

在色譜分析的綜合技術中，尤其對痕量組分的檢測，衍生化反應已成為重要手段之一。在薄層色譜中，有些化合物本身無色，又無紫外吸收與熒光，同時也找不到合適的顯色劑，或者有性質近似的化合物共存很難分離，這時可考慮在原位進行適當的化學反應，使之產生紫外吸收、熒光、顯色，或使性質發生較大差異以利于分離。第37頁，課件共52頁，創作于2023年2月

4生物與酶檢出法(bioautography)

生物檢出法又稱生物自顯影法是用生物檢定法檢出薄層上具有生物效應的物質如抗生素的方法。基于檢出物質的生物活性，將薄層板與已培養有適當微生物的瓊脂表面接觸，并置適宜溫度的培育箱內，經過一段時間后觀察抑菌點，有抗生素斑點處的培養基微生物生長受到抑制，整個瓊脂板出現了抑菌點，由此抑菌點可對該抗生素組分定位。酶檢出法實際上是一種酶抑制技術，用于薄層色譜檢出某些有機磷農藥。第38頁，課件共52頁，創作于2023年2月5放射顯影法（Autoradiography）

就是用含放射性同位素的化合物在薄層上顯示位置的方法。具體方法是使薄層上同位素的輻射線透過照相底片，顯影以后由于銀粒而顯出潛影，在一定劑量范圍內，放射性物質斑點使底片所呈暗度與斑點中放射性物質的濃度成正比，因此不僅可定位，還可定量。第39頁，課件共52頁，創作于2023年2月(七)薄層層析的定量測定

展開后，薄層分離所得斑點中化合物可進一步定量，其測定方法可分為兩大類：一類為洗脫測定法，將所需測定的斑點中的組分用適當溶劑洗脫，再選用適當方法定量；另一類為直接測定法，色譜分離后，直接用肉眼觀察比較或用儀器掃描斑點而測定其含量。第40頁，課件共52頁，創作于2023年2月1洗脫測定法1斑點的定位2斑點的洗脫:用吸集器將斑點位置的吸附吸下，然后用洗脫溶劑洗脫。3測定(1)紫外分光光度法：洗脫液調整至一定體積，在此化合物最大吸收波長處測定。同時把樣品斑點相應位置薄層吸附劑同樣取下做空白對照。(2)比色法：選擇靈敏度高、專屬性好的比色反應測定化合物含量，是比較常用的方法。(3)其它方法：極譜、庫侖滴定、熒光測定等。第41頁，課件共52頁，創作于2023年2月吸集器及減壓洗脫裝置

吸集器

減壓洗脫第42頁，課件共52頁，創作于2023年2月2直接測定法1目測法樣品經色譜分離后，直接觀察所得斑點的大小和顏色的深淺，并與標準品在相同條件下展開所得到的一系列已知不同濃度的標準斑點相比較，而近似地判斷樣品中所測成分的含量。2測面積法展開后色譜上的斑點面積與化合物含量間，符合一定的線性關系。3儀器測定法第43頁，課件共52頁，創作于2023年2月3儀器測定法

用光密度計或稱薄層掃描儀（TLCScanner）掃描定量，該方法已成為薄層定量的主要方法。

1.吸收測定法展開后的薄層，用一定波長單色光束進行掃描，記錄其吸光度的變化，得到掃描曲線。利用樣品掃描曲線上峰高或面積與標準品相比較，可得出樣品含量。

2.熒光測定法化合物本身有熒光或經過適當處理后生成熒光化合物者可測量其熒光強度而進行定量。

3.熒光淬滅法由熒光減弱的程度測出斑點中化合物的含量第44頁，課件共52頁，創作于2023年2月吸收測定法的分類

根據對光測定方式的不同，可分為三種：透射法反射法透射—反射法

透射法掃描反射法掃描

L光源；MC單色器；P薄層板；S斑點；PD光電檢測器第45頁，課件共52頁，創作于2023年2月儀器測定法的兩個重要參數掃描波長：

(1)單波長掃描：使用一種波長的光線對薄層進行掃描。

(2)雙波長掃描：是采用兩種不同波長的光束先后掃描所要測定的斑點，并記錄下此兩波長吸光度之差。掃描軌跡：直線掃描、鋸齒狀掃描、圓形掃描第46頁，課件共52頁，創作于2023年2月

化合物斑點的吸收光譜

單波長與雙波長掃描曲線的比較第47頁，課件共52頁，創作于2023年2月四特殊的薄層1.高效薄層色譜（HPTLC）2.棒狀薄層色譜（Rod-TLC）3.超薄層色譜（UltraThin-layerChromatography）第48頁，課件共5