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文檔簡介
細胞培養操作(cāozuò)規范第一頁,共二十八頁。精選ppt一:細胞培養的基本(jīběn)條件:1.無菌環境:細胞培養間消毒a:使用前紫外照射(zhàoshè)20-30分鐘b:使用完75%酒精擦拭臺面,紫外照射15分鐘。c:每兩周用84消毒液擦拭地面、臺面一次的方式進行消毒第二頁,共二十八頁。精選ppt超凈工作臺:使用前開啟柜內紫外燈照射15-30分鐘使用時開啟鼓風,在臺面內操作使用完畢后要用75%酒精將臺面和臺內四周(sìzhōu)擦拭干凈,紫外照射10分鐘。第三頁,共二十八頁。精選pptCO2
培養箱:1.設定的條件為37℃,5%CO2。2.使用CO2培養箱應注意的問題:?用螺旋口瓶培養細胞時,需將瓶蓋微松,以保證通氣。?保持培養箱內空氣干凈,定期消毒擦拭。?箱內蒸餾水槽中定期更換滅菌(mièjūn)蒸餾水3000毫升,以保持箱內濕度。第四頁,共二十八頁。精選ppt控制水盤內污染的方法:
1、
定期(至少每兩周一次),更換水盤內的無菌蒸餾水或無菌去離子水。2、
在水盤內添加適量硫酸銅,預防真菌(zhēnjūn)污染。配制方法:20g無水硫酸銅+5ml濃硫酸+1L滅菌純水。3、
水盤內添加適量抗生素。
4、定期為培養箱(含水盤)進行一次高溫滅菌。第五頁,共二十八頁。精選ppt2.細胞培養條件(tiáojiàn)細胞培養器皿:細胞培養瓶:?25平方厘米(加液量3-5ml)?75平方厘米(加液量10-15ml)?150平方厘米(加液量40ml)細胞培養板:第六頁,共二十八頁。精選ppt細胞(xìbāo)培養皿?35mm(加液量3ml)?60mm(加液量5ml)?100mm(加液量10ml)150mm
(加液量15ml)第七頁,共二十八頁。精選ppt常用(chánɡyònɡ)培養基:RPMI1640:適合許多種細胞,如腫瘤細胞、正常細胞的原代培養、傳代培養等。尤其適合人白細胞,如H9、HL-60、IM-9和K-562等細胞系的培養。DMEM:DMEM(A)【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】DMEM(H)【含谷氨酰胺、高糖型(4500mg/L)、除菌過濾滅菌】DMEM(L)【含谷氨酰胺、低糖型(1000mg/L)、除菌過濾滅菌】第八頁,共二十八頁。精選ppt血清:常用血清種類:胎牛血清、新生牛血清、小牛血清血清的滅活(消除補體活性)56℃,30分鐘。使用濃度:5%-20%,一般10%血清的消毒:過濾除菌血清解凍步驟(bùzhòu):–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天,至室溫下全溶后再分裝,一般用15ml無菌離心管分裝。第九頁,共二十八頁。精選ppt谷氨酰胺:谷氨酰胺在溶液中很不穩定,4℃放置1周可分解50%,故應單獨配制,置于-20℃保存(bǎocún),臨用前加入培養液。第十頁,共二十八頁。精選ppt消化液:胰蛋白酶溶液:常用濃度:0.25%。消化時間:2-10分鐘(顯微鏡下觀察)用含血清培養液終止(zhōngzhǐ)其對細胞的消化作用。第十一頁,共二十八頁。精選pptEDTA溶液使用濃度:?0.02%,與胰蛋白酶配合使用。?EDTA不能被血清中和,終止(zhōngzhǐ)消化后,需用培養液或PBS徹底沖洗培養瓶。第十二頁,共二十八頁。精選ppt二:細胞培養前準備(zhǔnbèi)工作:1.相關(xiāngguān)耗材:
細胞培養皿(瓶)若干、離心管(15ml,50ml)、100ml玻璃瓶4個、500ml玻璃瓶4個、2mL凍存管、tip頭及槍頭盒、吸管(10ml刻度)、吹打管、50ml、10ml、5ml注射器、一次性針孔過濾器(0.22um)、一次性口罩、帽子、手套、紗布、牛皮紙、標簽紙第十三頁,共二十八頁。精選ppt2.相關試劑及配制方法:細胞培養的相關試劑配制均在超凈工作臺上操作,嚴格按照無菌操作流程!完全培養基:基礎培養基90%
血清10%碳酸氫鈉(tànsuānqīnɡnà)
2.0g/L青、鏈霉素100U/ml過濾除菌4℃保存使用時加入谷氨酰胺(配制方法:谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液,充分攪拌溶解后,過濾除菌,分裝小瓶,-20℃保存,使用時可向100ml培養液中加入1ml谷氨酰胺溶液。第十四頁,共二十八頁。精選ppt胰蛋白酶-EDTA消化液稱取0.25g的胰蛋白酶和0.02g的EDTA用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液或D-Hank’s配制,用濾器過濾除菌,-20℃分裝(fēnzhuānɡ)保存。細胞凍存液配制:90%血清和10%DMSO第十五頁,共二十八頁。精選ppt3:常用培養器皿的清洗及消毒玻璃器皿的清洗刷洗(自來水)、浸泡(洗衣粉)、沖洗(自來水),烘干(50℃,恒溫(héngwēn)干燥箱)酸泡(24小時,至少6小時)、清洗(流水沖洗和蒸溜水沖洗15遍以上),50℃烘干。新的橡膠制品洗滌方法0.5MNaOH煮沸15分鐘或浸泡過夜,流水沖洗,0.5MHCl煮沸15分鐘或浸泡過夜,流水沖洗,蒸餾水沖洗15次以上,50℃烤干備用。第十六頁,共二十八頁。精選ppt消毒:消毒前常用的包裝(bāozhuāng):牛皮紙、棉布、鋁飯盒包裝(bāozhuāng)高壓蒸汽消毒:121℃,維持20-30分鐘。第十七頁,共二十八頁。精選ppt三:細胞培養方法(fāngfǎ)1.細胞復蘇方法:從液氮中取出冷凍管,迅速投入37℃水浴中,甩動凍存管,使其融化(1分鐘左右);5分鐘內用培養液稀釋至原體積的10倍以上;1000轉低速離心(líxīn)5分鐘;去上清,加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。第十八頁,共二十八頁。精選ppt2.細胞(xìbāo)換液方法:換液指針:觀察培養基顏色:當培養基的顏色由紅色漸漸褪成橙黃色,顏色清亮,無雜質,無渾濁觀察細胞生長狀態:細胞生長狀態良好,確認無細菌真菌污染換液方法:將吸管、廢液缸放入工作臺開啟細胞培養房及工作臺紫外消毒20分鐘,開啟恒溫水浴箱,培養液預熱關閉紫外燈,開啟工作臺上風機吸棄原培養液加入新的培養第十九頁,共二十八頁。精選ppt3.細胞傳代方法(fāngfǎ):傳代指針:觀察培養基顏色:當培養基的顏色由紅色漸漸褪成橙黃色,顏色清亮,無雜質,無渾濁顯微鏡觀察細胞生長狀態:細胞生長狀態良好,鋪滿培養瓶80%以上,細胞透亮,形態清晰,間隙無雜質,確認無細菌真菌污染第二十頁,共二十八頁。精選ppt傳代方法:將新的培養皿、吸管、廢液缸放入工作臺開啟細胞培養房及工作臺紫外消毒20分鐘,開啟恒溫水浴箱,培養液、消化液預熱關畢紫外燈,開燈,通氣,點燃酒精燈吸棄培養基,PBS清洗(qīngxǐ)兩次加入2ml消化液晃動培養瓶使消化液覆蓋整個細胞界面后吸棄培養液肉眼觀察細胞培養瓶底部出現一層云霧狀,輕輕敲打底部有塊狀物脫落,顯微鏡下觀察看到細胞間隙變大,細胞回縮變圓少量漂浮后加入10ml含血清培養基終止消化,吹打管吹打數次將細胞懸液吸至離心管,1000rpm離心5分鐘吸棄上清,加入PBS吹打混勻,1000rpm再次離心5分鐘吸棄上清,加入新鮮培養基,吹打混勻,按比例接種到細胞培養瓶第二十一頁,共二十八頁。精選ppt細胞消化時間(shíjiān)的控制:第二十二頁,共二十八頁。精選ppt4:細胞凍存:
吸出舊培養液加PBS沖洗兩次
胰酶消化
加培養基中止消化,(以上步驟同細胞傳代)細胞計數離心收集細胞,吸棄上清,加入凍存液調整細胞密度(mìdù)至1×106個/ml將細胞移入凍存管,寫好標簽(細胞種類,凍存時間)4℃15-30分鐘,-20℃1-2小時,-80℃保存,或過夜后至液氮罐內保存。第二十三頁,共二十八頁。精選ppt5:細胞(xìbāo)計數細胞計數(jìshù)板計數(jìshù)室構造數紅色邊框標記的四個方格內的細胞(xìbāo)總數(如有壓線則計上不計下,計左不計右)細胞數/ml=(4個大方格細胞總數/4)×104×稀釋倍數第二十四頁,共二十八頁。精選ppt四、細胞培養注意事項1.實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射20-30分鐘滅菌,以75%酒精擦拭無菌操作(cāozuò)抬面,并開啟無菌操作(cāozuò)臺風扇運轉10分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以75%酒精擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作第二十五頁,共二十八頁。精選ppt2.
無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗(shíyàn)用品用完即應移出,以利于氣流之流通。容器、培養瓶、培養板和培養皿實驗(shíyàn)用品以75%酒精擦拭外部后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在臺面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。切記開啟鼓風。3、
小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝下放置桌面。
第二十六頁,共二十八頁。精選ppt4.一次將所有的所需要試劑、工具放入工作(gōngzuò)臺。不要半路走出工作(gōngzuò)間拿東西,傳遞東西進工作(gōngzuò)室需酒精擦拭滅菌第二十七頁,共二十八頁。精選ppt內容(nèiróng)總結細胞培養操作規范。?箱內蒸餾水
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