實驗三

重組質粒DNA轉化大腸桿菌?#?技能教育實驗目的

學習將重組質粒DNA導入大腸桿菌的方法學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞的方法為下一步重組體篩選做準備?#?技能教育實驗原理

遺傳學中轉化的基本含義是使細胞獲得一新的可遺傳的表型性狀。分子克隆中用人工的方法將重組質粒DNA導入大腸桿菌細胞，使攜帶有重組質粒的大腸桿菌獲得在抗生素平板上生長的能力，從而與不攜帶重組質粒的的細菌區分開來，這個過程就是轉化。將重組質粒轉化進受體細菌時，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。大腸桿菌細胞經過一些特殊方法（電擊法、CaCl2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的細胞即感受態細胞(Competentcells)。?#?技能教育

轉化(Transformation)

是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。

0.1mol/LCaCl2是一種低滲溶液，在0℃低溫處理大腸桿菌細胞時，細胞膨脹成球形，DNA可吸附在其表面。在短暫的熱沖擊（如42℃）下，細胞可吸收外源DNA。為了鑒定這些轉化子，須利用質粒編碼的篩選標記，這些標記賦予細菌新的表型，是成功轉化的細菌很容易被篩選出來。pET32a質粒帶有氨芐西林抗性基因（Ampr），其重組體轉化的大腸桿菌能夠在含氨芐西林的培養基上生長，而未轉化的受體菌則不能再這種培養基上生長。

?#?技能教育Ampr：氨芐西林抗性基因–β內酰胺酶多克隆位點（MCS）：外源DNA片段的插入位點Amps菌株Ampr涂布于含Amp的培養基上，可以生長。次日可見白色菌落--轉化子。培養基上含有X-Gal和IPTG時，可使用藍白斑篩選方法鑒別真正的重組的轉化子。pET32apET32a?#?技能教育結構的三大要素：

多克隆位點選擇標記（耐藥性，LacZ）復制起始位點種類：

質粒噬菌體酵母人工染色體（YAC）反轉錄病毒載體表達載體等?#?技能教育?#?技能教育pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.?#?技能教育pET-32cloning/expressionregion?#?技能教育Vector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET32a-SmPR10?#?技能教育材料、設備及試劑

材料

E.coliDH5α菌株:R-、M-、Amp-(轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。）

pET32a-SmPR10質粒DNA（濃度：2ng/μl):實驗室自制設備

恒溫搖床；電熱恒溫培養箱；臺式高速離心機；超凈工作臺；低溫冰箱；恒溫水浴鍋；分光光度計；微量移液槍。?#?技能教育

試劑

1、LB固體和液體培養基

LB培養基配方：（單位g/L）

胰蛋白胨 10

酵母提取物 5NaCl 10

瓊脂粉（1.5%）15g（注：LB液體培養基不加瓊脂粉）按配方稱量藥品,加入一定量的ddH2O后置電爐上加熱熔解瓊脂，待瓊脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH調節pH至7.0。121℃濕熱高壓滅菌20分鐘，待冷卻至60℃左右,在超凈工作臺中加入一定量的Amp儲存液,使終濃度為100μg/ml,搖勻后用培養皿鋪板。?#?技能教育2、Amp母液：稱取氨芐西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm濾器過濾除菌，用1.5ml離心管分裝后儲存于-20℃冰箱.3、0.1mol/LCaCl2溶液:

稱0.56gCaCl2(無水分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22μm濾器過濾除菌或高壓滅菌。EP管分裝于4℃冰箱儲存.4、pET32a-SmPR10質粒：實驗室自制

?#?技能教育操作步驟（一）受體菌的培養1、取-70℃或-20℃貯存的大腸桿菌DH5α菌種，在LB培養液中培養過夜，進行活化;2、取幾微升活化后的菌液（取量視菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37℃培養箱中培養24h；從LB平板上挑取單菌落,接種于3-5mlLB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,直至對數生長后期。3、將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種于LB液體培養基中,37℃振蕩培養2-3小時至OD600＝0.5左右(生長對數期）。（注：這一步非常關鍵。培養過度的菌液含有較多的“老”細胞，制備成感受態細胞后其接受外援DNA能力較低，從而導致轉化率降低。）?#?技能教育（二）、感受態細胞的制備(CaCl2

法)1、將菌液轉入1.5ml離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃、4000rpm離心10分鐘。2、棄去上清,用預冷的0.1mol/L的CaCl2

溶液1ml輕輕懸浮細胞,冰上放置10分鐘后,4℃、4000rpm離心10分鐘。3、棄去上清,加入0.1ml預冷的0.1mol/L的CaCl2

溶液,輕輕懸浮細胞。每份100μl（注意懸液密度要均勻）,冰上放置備用。4、暫時不用的感受態細胞可置于-80℃保存。注：CaCl2處理后的細胞比較脆弱，盡量溫柔操作！?#?技能教育（三）重組質粒DNA的轉化質粒和感受態細胞混和：在100μl感受態細胞懸液中加入5μl重組質粒DNA（pET32a-SmPR10），輕輕混勻后冰上放置30分鐘。熱擊：42℃水浴中熱擊60秒（注：精確計算時間，熱擊過長將對細胞造成傷害）,熱擊后馬上置于冰上冷2-5分鐘。復蘇：向每管中加入800μlLB液體培養基(注：不含Amp),混勻后在37℃150rpm輕搖培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr)。思考：熱擊后的細胞已吸入外源質粒，如本實驗中的pET32a，該質粒可賦予宿主氨芐青霉素抗性。但是為什么復蘇時用的LB培養液不加Amp？?#?技能教育（四）涂布平板篩選轉化質粒

將管中培養液搖勻后取100μl均勻涂布于含Amp的篩選平板上。（注：將培養液搖勻后涂布。）2.正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃溫箱中培養過夜，次日觀察實驗結果。?#?技能教育預期實驗結果感受態細胞+重組質粒0.1MCaCl2+重組質粒感受態細胞+無菌水?#?技能教育實驗報告

思考題

(1).根據本實驗你認為影響轉化率的因素有哪些？

(2).如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現象？?#?技能教育實驗中要考慮的重要因素

為了提高轉化效率,實驗中要考慮以下幾個重要因素：

1.細胞生長狀態和密度:不要用經過多次繼代或儲于４℃的培養菌，最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600

來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。?#?技能教育2.質粒的質量和濃度:用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。10ng的cccDNA即可使100μl的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。3.試劑的質量:所用的試劑，如CaCl2

等均需是高純度的(G