基因工程技術：按照人們的愿望，進行嚴密的設計，通過體外DNA重組和轉移等技術，有目的地改造生物種性，使現有物種在較短的時間內趨于完善，創造出新的生物類型。質粒是一種染色體外的穩定遺傳因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、共價閉合環狀DNA分子cccDNA，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中，它具有自主的復制和轉錄系統。質粒在細胞內的復制一般有二種：緊密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在細胞周期的一定階段進行復制，通常每個細胞內只含有一個或幾個質粒分子；后者在整個細胞周期中隨時可以復制，在每個細胞中有許多拷貝。質粒的不相容性：利用共同復制系統的不同質粒不能在同一宿主細胞中共存。從細胞中分離質粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養細菌使質粒擴增；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。溶菌酶：破壞菌體細胞壁；SDS和TritonX-100：使細胞膜裂解。染色體DNA通常用于構建基因組文庫和Southern雜交等。基因組DNA的提取植物基因組DNA提取：提取緩沖液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，異丙醇—沉淀DNA（提染色體），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加鹽，70%乙醇—漂洗。細菌基因組DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：異戊醇（24：1）--沉淀DNA，苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）--抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—調節離子強度，RNaseA，CTAB/NaCl溶液—CTAB--一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，異丙醇/無水乙醇—沉淀上清液。總RNA制備mRNA的分子結構容易受到RNA酶的攻擊反應而降解，加上RNA酶極為穩定而且廣泛存在，因此，在提取過程中應嚴格防止RNA酶的污染并設法抑制其活性，這是實驗成敗的關鍵。儀器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液處理—所有器皿最后硅烷化處理。RNA酶抑制劑：DEPC--強烈但不徹底，與氨水溶液混合會產生致癌物；異硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制劑（RNasin）SDS,尿素等。細胞內總RNA制備方法：異硫氰酸胍熱苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先將組織在液氮中研磨成粉末）異硫氰酸胍熱苯酚法：異硫氰酸胍(GIT)與β－巰基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT與十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)作用使蛋白質變性。酚/SDS法：用酚和SDS破碎細胞和去除蛋白質，用LiCl選擇沉淀RNA以去除DNA和其它不純物。Trizol法：Trizol試劑（含酚、異硫氰酸胍和溶解劑等）。mRNA提取制備mRNA原理：分離的總RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特點，用oligo(dT)纖維素柱分離，當RNA流經oligo(dT)纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上，然后逐漸降低鹽濃度洗脫，在低鹽溶液或蒸餾水中，mRNA被洗下。然后經過兩次oligo（dT）纖維素柱，可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上樣buffer和洗脫buffer）。溶液中無鹽時要沉淀RNA，必須加鹽NaAC。講瓊脂烘糖凝摧膠電呆泳默DN喚A凝扮膠電結泳：慢瓊脂爬糖鳥--夸有分離掘DN盆A片立段大俯小范衫圍廣滿；聚糖丙烯烈酰胺識--鞋城小片猾段，惰分辨稅力高螞。辮瓊脂危糖凝突膠電圾泳特菌性粥：1廁.D腦NA枝分子放大小隔：D炭NA單分子寺在一庭定瓊應脂糖贏濃度喬下的摘遷移療率；訂2.延瓊脂鑄糖濃澤度：暴1.環0-本1.捧2%夕；3和.D宇NA丹分子惑構象占：超揚螺旋飄DN逢A最慈快，監線狀改雙鏈濟最慢診；4娛.電狡源電勵壓：禁不大戒于5傭V/膠cm略，負澆—吐正；堪5.董染料凳：溴邊化乙掃錠（爭EB王）-懷-強吃誘變置劑；貌6.個離子墻強度兄：0壟.5造*T命BE帆（不穗能過親高，尾避免球bu引ff蠢er島發燙膊）索。階RN泛A凝宇膠電肌泳逢：霧RN道A分射子有聲很多析二級徑結構中，需裂經變買性劑張處理陪，可與以破駝壞R虜NA疊中的趙二級肥結構禿。然呈后，餃用瓊啦脂糖然凝膠嫌電泳新可分軍級分槽離不梯同大份小的踢mR笨NA鞭分子碎。透RN規A瓊亞脂糖行凝膠獄電泳勒方法農有三繳種率：安乙二壩醛變串性電查泳、失甲醛周變性懲電泳菊和羥井甲基恐汞（勝劇毒膜）瓊匪脂檔變性蠻電泳奸。龍DN踏A限東制性免內切顏酶倒限制未性內泉切酶兩：箭限制醉性內返切酶襲是指切能特接異性監結合壤于一池段被痰稱為繼限制笑性識偵別序塔列的吵DN燥A走序列匆之內閉或其鴿附近行的特東異性礙位點博上，申并切助割雙字鏈潛DN六A碼。延I叉類酶雕：炮結合虛于識辰別位屑點并各隨機夏切割擾識別斷位點樂不遠暑處的靠DN遭A窯；噴II斑類酶惜：應由二抽種酶型分子廚組成化的二述元系繩統樣（核慢酸酶廈—僵切割暢、甲留基化慰酶庫—豐修飾估）罵，其牧識別保位點機和切涂割位望點是蝦同一糾位置志；膀II召I摘類酶追：舍在識扶別位俊點之季外切認割傳DN產A畝分子樹，然煤后從婦底物釣上解拌離。誓甲基古化：取保護艘DN支A分疊子，鄙越活詳躍的頁地方上，甲谷基化刑程度板越低趴。彼切割側性能衫：什回文苦對稱妄特異夏核苷齒酸序幸列、絕平末烈端D足NA團片段商、粘嘆性末跟端。挺酶單皺位：味在合延適緩墾沖液倚和反夕應溫諷度下擋，在況20趨ul幻反應智體積以中一輪小時谷內完秧全降供解早1騰m暖g炭DN允A畫所需脫要的埋量癢。舒載體住：苗把一乖個有仆用的姑目的擦D匪NA專片段對通過物重組充DN默A維技術絕，送刑進受棋體細宋胞中衡去進評行繁辨殖和歇表達工的工強具。拒常見飾載體冬：質球粒、嗚λ踩噬菌遵體、蒜粘粒譯、B謎AC晝、Y錘AC結等很。陰質粒骨載體垃的特托性六：蓋分子饒量小謠、多些拷貝展、松械弛控掉制型腐；肆具有缸多種矛常用蔥的限硬制性坦內切挎酶的盤單切肉點流；允能插次入較陪大的笑外源似DN辨A片欠段齊；禾具有稀容易攝操作他的檢怎測表額型勤。蔑pB搏R3級22屬、在pU賞C1震8/兆19鹿（分引子量倍更小跳、酒α奪-互票補原膽理變—樸藍白酷篩選步、多士克隆填位點歸區M止CS熊）騰、瓶pB躲lu援es賺cr肥ip到t俗SK觀(+媽/-算)檔（M冒CS勁）膊。株乳糖些操縱汽子：之α暈-互旦補原友理：漆la束cZ鈴（徒β溫-林半乳像糖苷移酶漆基因報）善基因外上缺隱失近肆操縱旗基因喚區段興的突若變體象與帶徒有完費整的擊近操蒼縱基東因區葉段的齊β及-蝴半乳炭糖苷嘗酶陰僅性突叉變體喇之間臭可以陰實現磚互補漠的現喜象評。節藍白揭斑篩活選焦：X安-g戚al榆--壟--前-I初PT惡G（僻乳糖搬類似脫物盜—騙誘導艙劑）樸--替--霉--植--顫藍色掀吲哚身產物后（當夏外源略片段紐插入幣后，雹失去蟻α任-磨互補四能力曉，因盛而不直產生鑄β古-寨半乳磁糖苷鍬酶，表無法共分解語培養親基中芝的乳蹦糖，鴉菌落枯呈白奇色）難。羊λ走噬菌銜體留：侵宴染細紗菌的鉛病毒它（裂鍛解性蔽侵染獵、溶異源性波侵染舍）。丟【堿怕性磷星酸酶收--碧活性暫好,拼但較搶抗熱拜和去購污劑巴,在凍去磷樣酸化佩反應燙后很烤難去猜除】縫細胞己轉化圾（t閑ra衡ns顆fo己rm讓at環io考n）熔是將膚外源坊DN悼A分邀子引琴入受敗體細毅胞，升使之云獲得導新的躺遺傳弓性狀萬的一迅種手扛段笨（E伙.c味ol洲i）悶。區【財如需揮將質豪粒載廳體轉號移進嗚受體帶細胞刺，需想誘導紐受體捎細胞季產生研一種逆短暫義的感馬受態幕以攝汗取外輪源D食NA韻.存】膚感受墳態細睛胞：乘受體躺細胞江經一憂些特碑殊方錯法（要如史Ca冊Cl好2腳、R削bC陪l（里KC干l）晝等化蠶學試蠟劑）營處理鹿后，蹤細胞塞膜的劉通透倒性發澆生了機暫時勸性改憶變，露成為鑼能允摧許外塵源D賞NA因分子困進入護的細華胞狀赤態。圈【L蹄B培托養基慎不含逢Am酷p，擾設2喝個對估照（捎防污卸染）費】候提高請轉化流效率睜的因慨素額：煤細胞廢生長鉆狀態獸和密哲度效（剛續進入拍對數情生長議期）器、診質粒叢的質除量和歪濃度挺（D添NA磨溶液舊體積使不超驅過感彎受態叫細胞窮體積抄的5駛%）呈、你試劑決質量轎（最榴高純棍度）嶄、防宗止雜拆菌和顯雜D下NA坊污染敵（無遞菌器穴皿）絨。挪PC績R集技術隙的3意個步孤驟：烤變性芝：肢目的兇雙鏈伴DN嫩A在扒94區℃節下解孩鏈；均退火曲：兩鉛種寡醬核苷跨酸引狠物在釋適當且溫度拘（5版0洞℃述左右倚）下探雨模掏板上哄的目攤的序蚊列通皇過氫幕鍵配強對；銹延伸智：T怕aq頂DN喜A聚丸合酶繪合成蝦DN逢A的埋最適麻溫度嗚下，孫以目微的D善NA掘為模好板進預行合蕉成。廉PC俗R反旋應5放要素紗：引奸物、婦模板誓、酶耽、d羽NT光Ps走和M碼g平2+悔引物吃設計鄙原則取：喪1.紅引物職長度捎：（運20事bp畢）；薦2.狼引物彩擴增喝跨度團：2康kb精左右愁最有臺效；順3.脅引物吉堿基低：G失+C儀含量族40赤-6圍0%鈔為宜削，A秀TG怪C分若布均歐勻，序不要被集中瓶；4貍、避拐免引起物內家部出沸現二蛾級結斥構，幫避免能兩條成引物湖間互偏補；斥5.坊引物丘3溪’很端的與堿基始：嚴恨格要贈求配燕對；差6.但引物材中有俯或能拋加上極合適毀的酶驅切位樓點；餓7.碌引物痛的特休異性醒：與也其他土序列變無明屋顯同喂源性刊；8書.擴傭增產畏物本虹身無禮穩定蘿二級拜結構遲（以疼免產運生非蔽特異洽性）哄；9殖.引良物量速：濃宰度要鋪控制姓。彈模板道：可轉以是桃DN育A或笑RN昨A，賊可以懼是線焰狀或骨環狀名。陪Ta狀qD臣NA臺聚合德酶：票活性倡半衰雖期為疤92墻.5梅℃春（最胡后加仿入）開。桐dN紗TP立s：分質量拌、濃燈度與懇PC機R擴汗增效文率有胳關，抵應保獵存得醒當，脅不好隆凍融慘，最活好分總裝。祝Mg鍋2+楚：浙對P證CR補擴增緞的特棒異性勉和產采量有腔顯著割影響宏，濃棵度過趙高，翅特異渣性降礙低，生出現喂非特抬異性倡；過籠低，帝降低畏Ta升qD祥NA虜聚合誕酶活旅性，趨使反楊應產沿物減忙少。遺反應碎緩沖狠液：扯Tr欄is冊.C雹l蛙，K班Cl板，和訓適當隙濃度蘿的M妖g水2+枕。訓（B搭SA證、D役DT付）魯PC混R反使應條俊件：癥溫度而、念時間泳和循栽環次煎數。救溫度諷：深變性慢：9叔4毒℃溫，退收火：凝Tm燃=凳4(兇G+笛C)蹦＋2鴨(A蝦+T泄)嗚，欲值約務低5掌℃染，延來伸：石72纏℃害。換循環社次數拍：2咸5-伶30鑰循環咐。【阿PC茅R常驕見問秒題：姐無擴挪增產天物、撒非特遮異性洞擴增輔、拖餐尾、金假陽辭性】行實時柿熒光邪定量衰PC中R技隆術：億技術父是一椅種在僅PC安R反扣應體塑系中陜加入思熒光仗基團聰，利冒用熒痰光信瓶號積建累通草過對倒P谷CR慰浮擴增扁反應鄙中每屋一個慣循環悠產物碧熒光惰信號分的實拌時檢潛測從紗而實朋現對撇起始多模板差定量浪及定安性的杰分析營。掛檢測珍模式序有：蛾Ta更gm著an偷陜探針賊和S涼YB欺R哥G嶄re章en涼I京檢測段模式急。暴SY她BR新G吩re桌en窩I卻染喚料方棒法夠：坡是一故種結驕合于診小溝龜中的開雙鏈贏D船NA壽結合超染料熟，娘與雙敬鏈幟D役NA慰磁結合陽后，緊其熒貴光大再大增鵝強。爪熒光抵閾值琴：彎在熒亂光擴遞增曲騰線上欣人為擾設定湖的一侮個值帆。嫁CT燦值優：樸每個林反應倡管內逼的熒樓光信很號到潛達設通定的偶域值符時所歲經歷濫的循卸環數拋。李Ta宵gm合an朵拾探針碎：腔是一季種寡冠核苷習酸探宇針，遠它的死熒光井與目納的序麻列的夢擴增鍬相關虎。禾RA存PD三（隨理機擴糠增的狠多態謝性D秩NA偷）恥：戰運用已隨機例引物帥擴增薯尋找蹲多態梅性D卷NA哈片段翅可作綿為分殃子標呆記。宅原理供：殖利用其一系饞列（考通常期數百金個）街不同萍的隨廢機排個列堿握基順簽序的虹寡聚蹦核苷假酸單渡鏈（該通常尖為1伯0聚模體）瘡為固引物白，對芳所研鄙究傘基因坐組撿DN睛A得進行默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