高中生物選修一基因工程的基本操作程序第一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞操作過程目的基因的檢測與鑒定2023/6/82第二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二什么叫基因？基因－－有遺傳效應的DNA片段。什么叫遺傳效應？

遺傳效應－－能轉錄為mRNA，繼而翻譯為蛋白質；能轉錄為核糖體RNA；能轉錄為轉運RNA。第三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二原核細胞的基因結構編碼區非編碼區非編碼區編碼區上游編碼區下游調控遺傳信息的表達(調控序列)轉錄RNA(編碼序列)第四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二編碼區非編碼區(下游)非編碼區（上游）(與RNA聚合酶結合位點)啟動子(轉錄終止標記)終止子原核細胞的基因結構轉錄RNA(編碼序列)第五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二

RNA聚合酶能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質.終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結合位點的一種蛋白質.第六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二編碼區非編碼區非編碼區外顯子(能編碼蛋白質)啟動子內含子(不能編碼蛋白質)真核細胞的基因結構上游終止子下游真核細胞的一個基因的編碼區轉錄出mRNA，需把其中的內含子切除，外顯子拼接成成熟mRNA。(結構基因)第七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA

聚合酶結合位點（啟動子）。非編碼序列：包括非編碼區和內含子第八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二獲得目的基因的方法從基因文庫中獲取目的基因（1）什么是基因文庫？（2）怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組文庫：部分基因文庫：(如cDNA文庫)利用PCR技術擴增目的基因人工合成

含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因未知序列基因較小已知序列已知序列2023/6/89第九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二提取某種生物的全部DNA用適當的限制酶切一定大小的DNA片段將DNA片段與載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫（1）直接分離法(鳥槍法)1.構建基因文庫——將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。第十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二某種生物的單鏈mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反轉錄酶DNA聚合酶（2）反轉錄法：cDNA的合成流程圖解第十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二cDNA合成過程

第一步，反轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。2023/6/812第十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二依據：目的基因的有關信息。如：根據基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉錄產物mRNA基因的表達產物蛋白質等特性。2．如何從基因文庫中得到所需要的基因？2023/6/813第十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二基因組文庫：一般針對原核生物的基因，因為基因少部分基因文庫：一般針對真核生物的基因，如cDNA文庫文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小小大基因中啟動子無有基因中內含子無有基因多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因物種之間的基因交流可以部分基因可以說明基因文庫的組建過程就包含基因工程的基本操作步驟。從基因文庫中獲取目的基因的優點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性.基因文庫的構建方法2023/6/814第十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二利用PCR技術擴增目的基因2023/6/815山西省孝義市第二中學第十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術③條件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）⑤結果：選修3P10聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA雙鏈復制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增利用PCR技術擴增目的基因2023/6/816第十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復性55℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈2023/6/817PCR擴增儀第十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/818第十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二PCR技術DNA復制過程DNA變性（90～95℃）→退火（復性55~60℃）→子鏈延伸（70~75℃）→重復循環DNA復制起始，RNA引物形成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同點原則堿基互補配對條件模板、原料（dCTP、dATP、dGTP、dTTP）、能量、酶、引物等不同點解旋方式氫鍵在高溫下斷裂，雙鏈全部解開解旋酶催化氫鍵逐步斷裂場所體外主要在細胞核中引物DNARNA酶熱穩定DNA聚合酶（Taq酶）解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等結果在短時間內形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子利用PCR技術擴增目的基因2023/6/819第十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成1）反轉錄法：

以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據已知的氨基酸序列合成DNA法：2023/6/820人工合成的目的基因第二十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/821第二十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二

——基因工程的核心1、目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發揮作用。(二)基因表達載體的構建第二十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2、基因表達載體的組成：復制原點+目的基因+啟動子+終止子+標記基因它們各自的作用是什么?第二十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來第二十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二①載體與表達載體的區別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意第二十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二(三)將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農桿菌、枯草桿菌等。將目的基因導入受體細胞的原理：借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。轉化——目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達2023/6/826第二十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——

感受態細胞吸收DNA分子(三)將目的基因導入受體細胞2023/6/827第二十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二1、將目的基因導入植物細胞的方法：（1）農桿菌轉化法

①農桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力②原理：Ti質粒上的T---DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。第二十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二③過程：④優點:經濟和有效目的基因插入Ti質粒的T-DNA上農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的染色體上目的基因的遺傳特性得以維持穩定和表達第二十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（2）基因槍法（3）花粉管通道法第三十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2、將目的基因導入動物細胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵培養新性狀動物第三十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二3、將目的基因導入微生物細胞①原核生物特點：繁殖快、單細胞、遺傳物質少②方法：用Ca2+處理細胞感受態細胞表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子第三十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二細胞類型常用方法受體細胞轉化過程植物細胞農桿菌轉化法體細胞將目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→轉入農桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA動物細胞顯微注射技術受精卵將含有目的基因的表達載體提純→取卵→受精卵→顯微注射→早期胚胎培養→胚胎移植→發育成為具有新性狀的動物微生物細胞Ca2+處理法原核細胞用Ca2+處理細胞→感受態細胞→重組表達載體DNA分子與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子將目的基因導入受體的方法2023/6/833第三十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（一）、檢測1、檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因①.首先取出轉基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針③.使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功第三十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二歸納步驟第三十五頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二DNA分子雜交技術過程詳解——從轉基因生物中取出含有目的基因片段的雙鏈DNA，然后加熱使之變性成兩條單鏈。再用DNA探針與這兩條單鏈分別雜交（即復性，產生雙鏈）。所謂的探針就是含有目的基因的同位素標記過的DNA片段。當目的基因成功導入我們要測的基因上時，探針就可以與之進行堿基配對。當目的基因未成功導入時，探針便無法與之正確配對形成雙鏈產物。這樣，通過檢測新合成雙鏈產物的放射性就可以判斷導入是否成功了。第三十六頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二（二）、鑒定（個體生物學水平）2、檢測目的基因是否轉錄出了mRNA3、檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交②過程:用上述探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明目的基因轉錄出了mRNA第三十七頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二

Western雜交（抗原—抗體雜交）具體做法是：第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達出蛋白質；第二步，將表達出的蛋白質注射動物進行免疫，產生相應的抗體，并提取出抗體（一抗）；第三步，從轉基因生物中提取蛋白質，走凝膠電泳；第四步，將凝膠中的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；第五步，將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交，這時抗體（一抗）與目的基因表達的蛋白（抗原）會特異結合。由于這種抗原—抗體的結合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結合，二抗抗體上帶有特殊的標記。如果目的基因表達出了蛋白質，則結果為陽性。第三十八頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二歸納步驟第三十九頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二

目的基因的檢測與鑒定檢測步驟目的方法原理工具現象1DNA分子雜交技術堿基互補配對放射性同位素作標記的含目的基因的DNA片段雜交帶2檢測目的基因是否轉錄出了mRNADNA分子雜交技術堿基互補配對放射性同位素作標記的含目的基因的DNA片段雜交帶3檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗原-抗體雜交抗體的專一性特定抗體雜交帶(陽性反應)檢測轉基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因2023/6/840第四十頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯鑒定：第四十一頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二2023/6/842第四十二頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二尋根問底——P9為什么要構建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內提取不行嗎？提示：構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫。2023/6/843第四十三頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二尋根問底：將目的基因直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結果會怎樣？——P11提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因導入了受體植物。此法目前爭議頗多，嚴格來講不算基因工程。44第四十四頁，共四十八頁，編輯于2023年，星期二思考與探究：1.作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；（5）有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融