漢族人維生素D受體基因TruⅠ和FokⅠ多態性與腰椎間盤退變的關系【摘要】［目的］探討漢族人維生素D受體基因多態性與腰椎間盤退變的關系。［方法］收集182例漢族人靜脈血標本和腰椎MRI，其中對照組101例，病例組81例。用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法測定2組標本的VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位點多態性；根據MRI顯示的信號差異按Schneiderman分級法確定各個體腰椎間盤的退變程度，分無、輕、中、重4組。分析病例對照組中基因型、等位基因頻率的分布規律，分析其中小于45歲者基因型及基因頻率分布與椎間盤退變程度的關系。［結果］對照組中FokⅠ和TruⅠ的等位基因頻率分布為：F%，f%和T%,t%；病例組中FokⅠ和TruⅠ等位基因頻率的分布為：F%，f%和T%,t%，二組中的分布差別無統計學意義，P＞;在MRI分組中VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位點的基因型和等位基因頻率在組中分布差異也無顯著性，P＞。［結論］VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位點多態性和漢族人LDD無關。

【關鍵詞】維生素D受體基因單核苷酸多態性限制性片段長度多態性腰椎間盤退變

AssociationofvitaminDreceptorgeneTruⅠandFokⅠpolymorphismswithlumbardegenerativediscdiseaseinHannationality∥

Abstract：［Objective］ToinvestigatetheassociationofVitaminDReceptorgenepolymorphismstolumbardiscdegnerationinHannationality.［Method］BloodsamplesandMRIfrom182Hanpeoplewerecollected,including81patientswithLDDand101healthyTruⅠandVDRFokⅠpolymorphismsweretestedbyPCRRestrictionFragmentLengthPolymorphismleveloflumbardiscdegenerationinthecasesyoungerthan45yearsoldwasdeterminedbythesignalintensityonMRIaccordingtoSchneidermansclassificationsystem,anddividedintofourgroups;no,slight,moderate,andseveredistributionofthegenotypesandallelefrequenciesinthecasecontrolgroupswereanalyzed;thesamedistributionruleintheMRIgroupswerealsoanalyzed.［Result］ThefrequenciesoftheVDRFokⅠandVDRTruⅠallelesinthecontrolgroupwere:F%,f%,T%,t%,%,f%,T%,t%inthepatientgroups,itshowednostatisticallydifference,P＞;thedistributionintheMRIgroupshadnotdifference,P＞［Conclusion］VDRTruⅠandFokⅠpolymorphismsarenotrelatedtoLDDinHannationality.

Keywords：vitaminDreceptorgene;singlenucleotidepolymorphism;restrictionfragmentlengthpolymorphism;lumbardiscdegeneration

腰椎間盤退變可引發多種骨科常見病，包括腰椎間盤突出、椎間不穩、椎間盤源性腰腿痛等一系列以腰腿痛為主要癥狀的疾病。近幾年研究發現IL1、IL6、膠原基因、TGF和維生素D受體等因子的基因多態性與LDD密切相關〔1〕。其中VDR基因與骨、軟骨代謝關系密切，其多態性與LDD的關系備受關注〔2〕。本實驗中作者通過研究漢族人VDR基因TruⅠ和FokⅠ酶切位點多態性與LDD關系，尋找LDD可能的遺傳風險因子。

1材料和方法

測定對象

病例組

選取2004年11月～2005年2月中山大學附屬第二醫院、廣州軍區陸軍總醫院、廣東省中醫院骨科門診及住院無血緣關系的漢族人LDD患者81例。其中男41例，女40例；平均年齡歲。所有患者均經MRI檢查確診，病程1周～5年，平均11個月。排除椎體腫瘤、椎體滑脫、脊柱感染性疾病等。MRI掃描時為脊柱協同線圈，T2加權像時TE為120ms，TR為3500ms，層厚/層距為/mm。L3～S1椎間盤退變情況根據MRIT2加權像中椎間盤信號強度變化進行判斷。分級評定按照Schneiderman4級法評分〔3〕：1級：椎間盤信號無缺失；2級：椎間盤信號中度缺失；3級：椎間盤信號重度缺失；4級：椎間盤信號完全缺失。每個對象中椎間盤信號≥2級為退變，3個節段的級數相加為退變總評分。

圖1按Schneiderman4級評分法左：L3、4、L4、5、L5S1椎間盤信號分別為1級、2級、3級；右：分級為1，3，4

考慮到肥胖、吸煙、工作方式及其余與遺傳有關的疾病的影響，因此排除以下對象：體重指數大于kg/m2和重度吸煙者;司機、木工等職業工作者；強直性脊柱炎、糖尿病、高血壓等病患者。

對照組

健康志愿者101例，也為無血緣關系的漢族人。其中男40例，女61例，平均年齡歲。所有志愿者均行腰椎MRI檢查并按分級分組。排除標準同病例組。2組檢測對象均取得知情同意。

主要試劑

DNA提取試劑盒為QIAGEN公司產品，引物合成、PCR產物測序由上海英俊基因有限公司完成，TaqDNA聚合酶、dNTP為TaKaRa公司產品，普通及梯度PCR儀均為Biometra公司產品。MR機為德國西門子公司產品。限制性內切酶為NEB公司產品。

方法

DNA提取

取抗凝全血5ml，采用酚氯仿法提取基因組DNA。

VDRTruⅠ基因型測定〔4〕

引物：A：5′-GGCAACCTGAAGGGAGACGTA-3；B：5-CTCTTTGGACCTCATCACCGAC-3。反應體系：模板DNAμl，dNTP2μl，10×緩沖液μl，引物A、B各μl,TaqDNA聚合酶μl，用無菌去離子水補足總體積至25μl。循環參數為預變性94℃10min，94℃5s，55℃退火10s，72℃延伸15s，35個循環，72℃延伸10min。擴增片段長度為461bp。

取部分擴增產物行分光光度定量，其余產物濃度用凝膠成像法半定量。按產物的濃度取不同量加入到10μl酶切體系中，加入TruⅠ內切酶U，10×緩沖液1μl，用無菌去離子水補足總體積至10μl，混勻。反應條件：65℃水浴6h。酶切片段與金染料充分混合后分別經%～3%瓊脂糖電泳，等位基因t顯示361bp和100bp2個片段，等位基因T顯示461bp1個片段。

VDRFokⅠ基因型測定

引物：A：5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′；B：5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTTCCCTC-3′。反應體系：模板DNAμl，dNTP2μl,10×緩沖液μl，引物A、B各μl，TaqDNA聚合酶μl，用無菌去離子水補足總體積至25μl。循環參數為預變性94℃10min,94℃45s,63℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環，72℃延伸10min。擴增片段長度為265bp。

定量方法同上，在10μl酶切體系中加入FokⅠ內切酶U，10×緩沖液1μl，用無菌去離子水補足總體積至10μl，混勻。反應條件：37℃水浴24h。酶切片段與金染料充分混合后分別經%～3%瓊脂糖電泳，等位基因f顯示169bp和96bp2個片段，等位基因F顯示265bp1個片段。

統計分析

所有數據采用SPSS軟件進行統計學處理。計量資料以x-±s表示，其差異性測定采用t檢驗，計數資料用x2檢驗。組間等位基因和基因型頻率差異比較用x2檢驗；不同基因型與椎間盤退變節段數及椎間盤退變等級評分總和的關系用秩和檢驗KruskalWallis法進行分析。

2結果

2組中成員的特征

病例組中患者年齡為歲，25歲時體重指數為kg/m2，目前體重指數為kg/m2，對照組中患者年齡為歲，25歲時體重指數為kg/m2，目前體重指數為kg/m2，經t檢驗，發現2組中年齡、25歲時及目前體重指數差異無顯著性。另外，病例組中輕中度、重度勞動強度者分別為63、18例，對照組中則分別為86、15例，經x2檢驗，發現2組中患者勞動強度的分布差異亦無顯著性。

VDR基因型及等位基因頻率在病例對照組及MRI分組中的分布

在病例組及對照組中，VDRTruⅠ和FokⅠ位點各種基因型及頻率分布。各對照組符合HardyWeinberg定律。TruⅠ和FokⅠ位點各基因型和基因頻率分布經x2檢驗，差異無顯著性。

圖2電泳后等位基因t出現361bp和100bp2個片段，等位基因T出現461bp1個片段

圖3電泳后等位基因f出現169bp和96bp2個片段，等位基因T出現265bp1個片段

表1病例-對照組中VDRTruⅠ和FokⅠ位點多態性表達情況

VDR基因各位點多態性在MRI分組中的分布

由于2組中的研究對象均為隨機人群，故作者用MRI分析VDR基因多態性及LDD的關系。為排除年齡因素的影響，我們僅以2組中≤45歲者為研究對象；為排除勞動強度的影響，將所有個體分為輕、中、重3級；腰椎MRI分為無、輕、中和重度4組。

經統計顯示，VDRTruⅠ和FokⅠ單核苷酸多態性分布在任何一勞動強度層面，各基因型與腰椎間盤退變總節段數及退變總評分均無關。

表2VDRFokⅠ單核苷酸多態性與腰椎間盤退變節段數和評分的關系

表3VDRTruⅠ位點多態性與腰椎間盤退變節段數和評分的關系

3討論

VDR基因經過轉錄翻譯成維生素D受體，介導1，252D3發揮生物效應，是類固醇激素/甲狀腺激素受體超基因家族的成員。其基因定位于人12號染色體，基因序列長約100kb，由11個外顯子組成，使用核酸限制性內切酶已發現VDR基因100多種酶切位點多態性。其中FokⅠ酶切位點位于VDR基因的第2個外顯子中，有FokⅠ酶切位點時基因表達的VDR由427個氨基酸殘基組成；如果沒有FokⅠ酶切位點，基因表達的VDR僅含424個氨基酸殘基。大多數文獻表明存在FokⅠ酶切位點的ff型有較低的腰椎骨礦化密度和較高的髖關節骨丟失量，而FF型表達的VDR反式激活作用較強，因而具有較強的生物活性〔5〕。TruⅠ酶切位點位于VDR基因第8個內含子，雖然不改變VDR的蛋白序列，但轉錄出VDR基因的mRNA3′末端區域可以影響mRNA的表達和穩定性，影響增強子對靶部位的親和力。研究表明VDR基因酶切位點多態性與多種疾病相關，包括骨質疏松、骨關節炎、糖尿病、腫瘤、心血管疾病和慢性牙周病等，而與LDD相關性研究則較少。

Videman〔6〕等人收集白種人中85對男性雙胞胎的血液標本與胸腰椎MRI，考察VDR基因型與MRI的關系，發現在T6～S1節段，TaqⅠ基因型中Tt與tt型分別比TT型信號低%與%，而FokⅠ基因型中ff和Ff型平均的信號密度分別比FF型要低%和%。有統計學差異。后來Cheung等〔7〕考察漢族人TaqⅠ位點和LDD的關系，認為漢族人群VDR基因多態性與腰椎間盤退變存在一定的關聯。由于FokⅠ位點的變異可引起VDR蛋白序列的變化，從而改變VDR的蛋白結構，這種關聯性可能更大，因此作者考察FokⅠ位點與LDD的關系，但研究結果卻表明漢族FokⅠ位點與LDD退變節段無關，與退變總評分也無關，可能此位點主要影響骨代謝，而對軟骨代謝影響較小〔8〕。另外本實驗的結論與Videman等的報道有所不同，造成這種不同的可能原因是一方面與種族不同有關，另一方面也與所選取標本的年齡、勞動強度、飲食結構和生活習慣存在一定關系。有關TruⅠ的多態性國內外報道很少，YeWZ〔3〕等首先發現這個位點，在白種人群中分布規律為TT%,Tt%,tt%，基因頻率為T，t,后來ZajickovaK〔9〕再次證實了這個位點的存在。此實驗中作者用PCRRFLP法測定TruⅠ位點多態性，發現在漢族人中同樣也存在TruⅠ多態性，選擇對照組分析其基因頻率為T,t，表明漢族人t基因頻率出現的頻率比白種人群t基因頻率大，作者首次結合病例-對照組和MRI顯示的椎間盤退變程度分析這一位點的多態性與腰椎間盤退變的相關性，結果表明漢族人TruⅠ位點多態性在病例-對照組中分布無差別，與LDD退變節段無關，與退變總評分也無關。

LDD的病理基礎是椎間盤退變，作者從椎間盤退變引起的椎間盤退變性疾病的角度分析了VDR基因FokⅠ和TruⅠ位點單核苷酸多態性與椎間盤退變的關系，同時利用分層分析，去除勞動強度的影響后分析MRI顯示的信號與此2個位點多態性的關系。結果此2個位點單核苷酸多態性在病例-對照組中分布無差別，與L3、4、L4、5和L5S1椎間盤退變的節段數及椎間盤退變的評分無明顯關系。據此，作者認為漢族人VDR基因FokⅠ和TruⅠ位點單核苷酸多態性LDD的發病基礎無關。但VDR基因其他位點的多態性是否與LDD有關，還需進一步的研究。

【參考文獻】

〔1〕葉偉，黃東生，劉尚禮，等.IL6基因單核苷酸多態性與腰椎間盤疾病的關聯研究［J］.中國病理生理雜志,2006，22:647651.

〔2〕Videman,Tapio,etpolymorphismsofthevitaminDreceptorgeneassociatedwithintervertebraldiscdegeneration［J］.Spine,1998，23:24772485.

〔3〕SchneidermanG,FlanniganB,KingstonS,etresonanceimaginginthediagnosisofdiscdegeneration:correlationwithdiscography［J］.Spine,1987，12:276281.

〔4〕YeWZ,ReisA,VelhoofanovelTru9ⅠpolymorphisminthehumanvitaminDreceptorgene［J］.JHumGenet,2000，45:5657.

〔5〕UitterlindenAG,FangY,VanMeursJB,etandbiologyofvitaminDreceptorpolymorphisms［J］.Gene,2004，338:143156.

〔6〕VidemanT,Gibbo