一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖煜にa(chǎn)細(xì)菌性病原的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定的基本方法，了解所分離細(xì)菌性病原的形態(tài)特征及培養(yǎng)特點(diǎn)，了解細(xì)菌性滅活疫苗制備的基本過(guò)程。二、 實(shí)驗(yàn)材料患白內(nèi)障病虎紋蛙（或其他患細(xì)菌性疾病的水產(chǎn)動(dòng)物）、健康虎紋蛙、腦膜炎敗血黃桿菌（虎紋蛙白內(nèi)障病的病原）三、 實(shí)驗(yàn)藥品、用具2216E瓊脂平板、2216E瓊脂斜面、福爾馬林、無(wú)菌蒸餾水、生理鹽水、磷酸緩沖液、接種環(huán)、解剖刀、剪刀、鑷子、滴管、紗布、白瓷盤(pán)、酒精棉球、滅菌試管、96孔板、注射器、酒精燈、離心機(jī)（包括離心管）、水族箱、記號(hào)筆四、 實(shí)驗(yàn)操作程序（一）病原菌的分離與鑒定.培養(yǎng)基的制備（1）普通肉湯培養(yǎng)基：按以下劑量稱取各種試劑（先稱取鹽類再稱蛋白胨及牛肉膏），置于鋁鍋或搪瓷缸中。牛肉膏5g磷酸氫二鉀1g蛋白胨10g蒸餾水1000ml氯化鈉5gpH7.4?7.6初配好的培養(yǎng)基呈酸性故要用NaOH調(diào)整。將pH測(cè)定后的肉湯培養(yǎng)基用濾紙過(guò)濾，將過(guò)濾好的肉湯分裝試管、鹽水瓶、三角燒瓶等容器，待滅菌。（2）普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基普通肉湯1000ml瓊脂20g瓊脂是由海藻中提取得一種多糖類物質(zhì)，對(duì)病原性細(xì)菌無(wú)營(yíng)養(yǎng)作用，但在水中加溫可融化，冷卻后可凝固。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂1.5?2%即可固定培養(yǎng)基，如加入0.3?0.5%則成半固體培養(yǎng)基。將稱好的瓊脂加到普容肉湯中，加熱煮沸，待瓊脂完全融化后，將pH調(diào)至7.4?7.6。瓊脂融化過(guò)程中需不斷攪拌，并控制火力，不使培養(yǎng)基溢出或燒焦，并注意補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。加熱溶解好的培養(yǎng)基可用濾紙進(jìn)行過(guò)濾，固體培養(yǎng)基要用4層紗布趁熱過(guò)濾(切勿使培養(yǎng)基凝固在紗布上)，之后按實(shí)驗(yàn)要求，將配制好的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶中，包扎好待滅菌，將培養(yǎng)基置于高壓蒸汽鍋內(nèi)，121°C滅菌15?30min，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通瓊脂斜面，也可直立，凝固后即成高層瓊脂。鹽水瓶中的普通瓊脂以手掌感觸，若將瓶緊握手中覺(jué)得燙手，但仍能握持者，此即為傾倒平皿的合適溫度(50?60C)，每只滅菌培養(yǎng)皿倒入約15?20ml，將皿蓋蓋上，并將培養(yǎng)皿于桌面上輕輕回轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基平鋪于皿底，即成普通瓊脂平板。培養(yǎng)基中的某種成分，如血清、糖類、尿素、氨基酸等在高溫下易于分解、變性，故應(yīng)過(guò)濾除菌，再按規(guī)定的量加入培養(yǎng)基中。.病原菌的分離與培養(yǎng)分離病原菌的材料要求是具有典型患病癥狀的活的或剛死不久的患病生物，病原菌的分離方法如下。體表分離：先將病灶部位表面用70%酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用經(jīng)酒精燈灼燒的解剖刀燙燒消毒，再用接種環(huán)刮取病灶深部組織或直接挑取部分深部患病組織，接種于普通肉湯培養(yǎng)基增菌或直接在普通瓊脂平板上劃線分離。內(nèi)部組織器官：用70%酒精浸過(guò)的紗布覆蓋體表或用酒精棉球擦拭，進(jìn)行體表消毒，無(wú)菌打開(kāi)病魚(yú)的腹腔，以肝、腸、心臟等臟器為材料，先將擬分離病原的部位表面用70%酒精棉球擦拭或用經(jīng)火焰上灼燒后的解剖刀燙燒，以殺死表面的雜菌，隨即在燒灼部位刺一小孔，用滅菌的接種環(huán)（待冷2?5秒）伸向燒灼部小洞中，用手指將接種環(huán)輕輕旋轉(zhuǎn)兩次，借以達(dá)到取足材料的目的。左手持握普通瓊脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接種環(huán)在瓊脂平板上分區(qū)劃線接種。劃線時(shí)接種環(huán)面與平板表面成30?40度的角輕輕接觸，在平板表面輕快地移動(dòng)，接種環(huán)不應(yīng)嵌入培養(yǎng)基內(nèi)，且不要重復(fù)，否則形成菌苔。劃線完畢，蓋上皿蓋，接種環(huán)滅菌后放下，并在平皿底部用記號(hào)筆注明接種材料、日期及操作者代號(hào)。也可對(duì)實(shí)質(zhì)性臟器用無(wú)菌剪刀下一小塊，用鑷子夾住病料使其剖面接觸潔凈的玻片，作多個(gè)觸片，染色后在顯微鏡下直接鏡檢，能快速獲得結(jié)果。鰓部：用無(wú)菌接種環(huán)刮取鰓上的分泌物劃平板。血液及體液：用無(wú)菌注射器吸取病魚(yú)血液和體液，滴于平板涂布；或用滅菌后的接種環(huán)挑取血液和體液后于平板上劃線，分離細(xì)菌。接種后的平板經(jīng)30°C左右培養(yǎng)24?72h后，檢查菌落生長(zhǎng)情況，對(duì)菌落檢查的主要內(nèi)容包括：（1）大小：其大小以mm表示，微小菌落：針尖大，直徑小于0.5mm，如支原體菌落、豬丹毒桿菌菌落；小菌落：直徑在0.5?1mm之間，如嗜血桿菌、布氏桿菌菌落；中等大小的菌落：直徑在1?3mm之間，如巴氏桿菌、沙門(mén)氏桿菌菌落；大的菌落：直徑大于3mm，如炭疽芽孢桿菌菌落等。（2）形態(tài)：圓形，不規(guī)則形（根狀、樹(shù)葉狀）（3）邊緣：整齊，不整齊（鋸齒狀、蟲(chóng)蝕狀、卷發(fā)狀）（4）表面：光滑、粘液狀、粗糙、荷包蛋狀、漩渦狀、顆粒狀（5）隆起度：隆起，輕度隆起，中央隆起，平升狀、扁平狀，臍狀（凹陷狀）（6）顏色：無(wú)色、灰白色、白色、金黃色、紅色、粉紅色（7）透明度：透明、半透明、不透明（8）溶血性：p一溶血（完全溶血），a一溶血（不完全溶血），不溶血根據(jù)菌落數(shù)量和特征，挑選可能的病原菌菌落進(jìn)一步劃線純化1?2次后，將經(jīng)純化的可能病原菌用于感染試驗(yàn)。.病原菌的確定將從患病材料中分離的所有可能病原菌經(jīng)純化和擴(kuò)大培養(yǎng)后分別進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。目前最常用的人工感染接種方法有浸泡、口服和注射法等，究竟選用哪一種方法最合適，需要根據(jù)不同的疾病類型和可能的侵入途徑而定。如體表的病，可采用浸泡法（包括創(chuàng)傷浸泡）；體內(nèi)的疾病，可采用口服、注射法。由于絕大部分病原菌都是條件致病菌，因此在人工感染實(shí)驗(yàn)時(shí)還要注意感染菌的用量，接種量過(guò)大，即使該菌并不是引起實(shí)驗(yàn)材料致病的病原菌，也可能會(huì)因大量菌體裂解釋放的大量?jī)?nèi)毒素而使感染生物死亡，為了量化感染菌的危害程度，可以測(cè)定感染細(xì)菌對(duì)接種動(dòng)物的半數(shù)致死量（LD50），根據(jù)LD50的大小來(lái)判斷其致病力的強(qiáng)弱。只有LD50相對(duì)較低、感染引起的死亡與實(shí)驗(yàn)材料有相同癥狀、并且經(jīng)回接實(shí)驗(yàn)還能分離到相同的細(xì)菌時(shí)，才能確定所分離的細(xì)菌為引起實(shí)驗(yàn)材料致病的病原。在感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，感染對(duì)象要求是沒(méi)有患病史的同種生物，在感染前要經(jīng)過(guò)1?2周的暫養(yǎng)，感染數(shù)量要30尾以上（至少要10尾以上）。必要時(shí)，還要將溫度控制在適合疾病爆發(fā)的水平。感染過(guò)程中要定時(shí)投餌和換水，同時(shí)安排合適的對(duì)照組。.病原菌的鑒定分別觀察病原菌的形態(tài)以及檢測(cè)其各種生理生化指標(biāo)，通過(guò)查閱伯杰氏手冊(cè)確定病原菌的種類；也可直接用細(xì)菌鑒定儀測(cè)定病原菌的種類。（二）疫苗制備.病原菌的擴(kuò)大培養(yǎng)與分離液體培養(yǎng)：按配方配制2216E液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基用三角燒瓶分裝并蓋上棉塞后置于高壓蒸汽鍋內(nèi)，121°C滅菌15?30min，冷卻后于超凈工作臺(tái)內(nèi)加入1ml左右預(yù)先制備的病原菌菌液，蓋上棉塞，用搖床于28~30C下震蕩（約150rpm）培養(yǎng)24~48h。病原菌經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后以3000~5000rpm離心20~30min，取沉淀用PBS（磷酸緩沖液）配制成1%或1%。左右的菌懸液。茄子瓶擴(kuò)大培養(yǎng)：按配方配制2216E瓊脂培養(yǎng)基，于高壓蒸汽鍋內(nèi)，121C滅菌15?30min，趁熱倒入經(jīng)干熱消毒的茄子瓶?jī)?nèi)（每瓶約15ml培養(yǎng)基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超凈工作臺(tái)臺(tái)面，稍予搖動(dòng)使培養(yǎng)基平鋪于瓶壁，冷卻后制成茄子瓶平板。用無(wú)菌滴管吸取預(yù)先制備的病原菌菌液，在每個(gè)茄子瓶平板表面滴加3~4滴，再用經(jīng)灼燒消毒并冷卻的玻璃涂布器將菌液涂布均勻，28-30C下培養(yǎng)24~48h。用無(wú)菌PBS洗脫平板表面的菌苔，洗脫液經(jīng)3000~5000rpm離心20~30min，取沉淀用PBS（磷酸緩沖液）配制成約1%或1%的菌懸液。.滅活化學(xué)滅活：以福爾馬林作為化學(xué)滅活劑。滅活前先確定福爾馬林對(duì)該病原菌的安全滅活濃度，確定方法為：取7支滅菌試管，分別5ml加入預(yù)先制備病原菌菌液，其中6支裝有菌液的試管分別依次加入一定量的福爾馬林，使福爾馬林的終濃度分別為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，另1支試管不加入福爾馬林作為對(duì)照；于4°C下放置24h后，于每支試管中分別取0.2ml菌液于2216E瓊脂平板上涂布，28-30C下培養(yǎng)48h，檢測(cè)各試管內(nèi)細(xì)菌的存活情況，只有沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)應(yīng)福爾馬林濃度才是該病原菌的滅活安全濃度。向第1步中制備的1%菌懸液內(nèi)添加福爾馬林，使福爾馬林的最終濃度達(dá)到安全滅活濃度以上，于4C下放置24h，制備滅活菌液。其他滅活方法：除化學(xué)滅活，疫苗制備時(shí)還可采用熱滅活、紫外線和超聲波滅活等方法。.安全性檢測(cè)活性檢測(cè)：取0.2ml滅活菌于2216E瓊脂平板上涂布，28-30C下培養(yǎng)48h，只有在瓊脂平板上沒(méi)有出現(xiàn)菌落出現(xiàn)才說(shuō)明滅活徹底，滅活菌液中確實(shí)沒(méi)有活菌存在。安全檢測(cè)：將所制備的滅活菌液稀釋成疫苗接種所用的濃度（一般為108cfu），用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無(wú)患病史的同種寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）體內(nèi)，經(jīng)20d觀察無(wú)發(fā)病或死亡才說(shuō)明該滅活細(xì)菌是安全的。.效果檢測(cè)抗體效價(jià)檢測(cè)：用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無(wú)患病史的同種寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）體內(nèi)，連續(xù)養(yǎng)殖2個(gè)月，從第10d開(kāi)始每隔10d取3尾以上接種生物用微量血凝板法檢測(cè)其平均凝集抗體效價(jià)。抗體效價(jià)檢測(cè)方法為：抽取感染動(dòng)物血液并離心分離血清，用取樣器吸取0.1ml血清加入經(jīng)滅菌的96孔板的A1孔內(nèi)，在96孔板A行的其他孔內(nèi)加入0.05ml無(wú)菌PBS，從A1孔內(nèi)取0.05ml血清加入A2孔內(nèi)，混勻后再?gòu)腁2孔內(nèi)取0.05ml液體加入A3孔內(nèi)……，如此重復(fù)，使96孔板內(nèi)后1個(gè)孔內(nèi)的血清濃度均比前1個(gè)孔低1倍（倍釋法），再在96孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入0.05ml菌液（活的或滅活的均可），37C孵育過(guò)夜后觀察（最好在96孔板下墊一張黑紙以增加反差），出現(xiàn)沉淀的最高血清稀釋倍數(shù)即為血清中所含抗病原菌抗體的效價(jià)。比較不同時(shí)期內(nèi)抗體效價(jià)的變化情況，確定最高抗體效價(jià)值。一般情況下，抗體效價(jià)越高，滅活細(xì)菌作為疫苗的效果就最好。攻毒感染實(shí)驗(yàn)：選擇無(wú)患病史的同種同齡寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）作為感染對(duì)象，用注射法進(jìn)行攻毒感染。用注射法將稀釋后的滅活菌液接種到無(wú)患病史的同種寄主動(dòng)物（水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物）體內(nèi)，連續(xù)養(yǎng)殖2個(gè)月，從第20d開(kāi)始每隔20d取10尾以上接種生物用活的病原菌進(jìn)行感染，感染方法為。（二）致病菌的人工感染1）實(shí)驗(yàn)材料：嗜水氣單胞菌斜面（每組2支），試管架（1個(gè)）酒精棉球（1瓶），無(wú)菌生理鹽水，滅菌空試管，麥?zhǔn)媳葷峁堋?）實(shí)驗(yàn)方法：用裝有針頭的注射器（或無(wú)菌吸管），吸取無(wú)菌生理鹽水，滴注到培養(yǎng)有嗜水氣單胞菌的斜面上，振蕩使斜