慢性乙型肝炎不同脾虛兼證與外周血樹突狀細胞表型及功能的關系【摘要】目的：研究慢性乙型肝炎患者不同脾虛兼證與外周血樹突狀細胞表型及功能的關系。方法：CHB患者60例，按中醫證候診斷標準分為脾虛肝郁、脾虛濕熱和脾腎兩虛組，每組20例，10名健康人為正常對照。分離各組外周血單個核細胞，體外誘導培養DC，流式細胞儀測定DC表型，酶聯免疫吸附檢測法測定DC分泌白細胞介素10濃度，同步檢測患者生化指標及乙肝病毒的脫氧核糖核酸水平。結果：CHB患者DC體外誘導增殖能力較正常人下降，DC成熟表面標記物顯著低于正常人。不同證候CHB患者DC表面標記物CD80、CD86和CD1a表達陽性率均低于正常人。脾虛肝郁證患者CD80、CD1a和HLADR表達陽性率顯著高于脾腎兩虛證，脾虛濕熱證患者CD1a表達陽性率顯著高于脾腎兩虛證。CHB患者DC培養上清中IL10濃度顯著高于正常人。脾腎兩虛證患者DC培養上清中IL10含量高于脾虛肝郁證。結論：在CHB發病過程中，不同脾虛兼證CHB患者DC的表型及功能間存在差異，提示中醫證候分類與機體免疫功能之間存在一定相關性。

【關鍵詞】慢性乙型肝炎;樹突狀細胞;中醫學;脾虛;證候

Objective:Tostudythephenotypesandfunctionsofdendriticcells(DCs)derivedfromperipheralbloodmonocytesofchronichepatitisB(CHB)patientswithdifferenttraditionalChinesemedicine(TCM)syndrometypes,andtoexploretherelationshipbetweenTCMsyndrometypeandDCfunctions.

Methods:SixtyCHBpatientswereincludedinthisstudy.AlltheCHBpatientsweredividedintospleendeficiencyandliverstagnation,spleendeficiencyanddampnessheatanddeficiencyofbothspleenandkidneygroupsaccordingtoTCMsyndromediagnosisstandard.Therewere20casesineachgroup,andtenhealthypeoplewereincludedasnormalcontrol.Thevolunteer’speripheralbloodwascollectedformonocyteseparation,biochemicaltestandhepatitisBvirusDNAloadsdetection.DCswereinducedandisolatedfromperipheralbloodmonocytes,andthentheexpressionsofsurfacemarkersCD80,CD86,CD1aandHLADRweredetectedbyflowcytometricanalysismethod.Interleukin10(IL10)productionoftheDCswasquantifiedbyenzymelinkedimmunosorbentassay.

Results:TheproliferationofDCsintheCHBpatientswasslowerthanthatinthehealthyvolunteers().TheexpressionsofDCsurfacemoleculessuchasCD80,CD86,andCD1awereobviouslydecreasedintheCHBpatientsascomparedwiththoseinthehealthyvolunteers().Moreover,expressionsofDCsurfacemoleculesweredifferentamongCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ThepositiveexpressionsofCD80,CD1a,andHLADRintheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnationwereobviouslyhigherthanthoseintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney(),andtheCD1aexpressionintheCHBpatientswithspleendeficiencyanddampnessheatwashigherthanthatintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney().InDCculturesupernatant,theIL10concentrationoftheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidneywashigherthanthatoftheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnation(),andtheIL10concentrationsoftheCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypeswerehigherthanthatofthehealthyvolunteers().

Conclusion:DuringthepathogeniccourseofCHB,thephenotypesandfunctionsofDCsaredifferentinCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ItsuggeststhatthereisacorrelationbetweenTCMsyndrometypeandbodyimmunityfunction.

Keywords:chronichepatitisB;dendriticcell;traditionalChinesemedicine;spleendeficiency;syndrome

外周血樹突狀細胞是人體內功能最強的抗原提呈細胞，其功能狀態直接影響細胞和體液免疫應答。研究顯示慢性乙型肝炎患者存在不同程度的免疫耐受［1,2］，特別是存在樹突狀細胞功能缺陷，而健脾類中藥可改善CHB患者樹突狀細胞功能，提高機體免疫功能［3］。以脾虛為主的不同中醫證候分類之間可能存在DC活性的差別，本研究旨在研究CHB不同中醫證候分類患者DC表型及功能差異，探討DC成熟障礙的證候生物學特點。

1資料與方法

臨床資料

研究對象健康志愿者10名，為上海中醫藥大學龍華醫院職工。CHB患者60例，來自上海中醫藥大學龍華醫院肝科2008年6～12月門診患者。其中男37例，年齡19～60歲，平均歲，病程2～20年，平均年；女23例，年齡23～59歲，平均歲，病程2～19年，平均年。

診斷標準西醫診斷標準參照2000年中華醫學會《病毒性肝炎防治方案》［4］標準。中醫證候分類標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》［5］及《中醫診斷學》5版教材［6］，以臨床表現及舌苔脈象為依據制定脾虛肝郁、脾虛濕熱和脾腎兩虛證候判別標準。入選病例半年內均未接受免疫調節治療，兩周內未接受中藥治療。

研究方法

試劑儀器雙抗培養液RPMI1640培養基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素4購自美國Peprotech公司；熒光標記CD80FITC、CD86PE、CD1aPECY5和HLADRAPC單克隆抗體購自美國BD公司；白細胞介素10試劑盒購自美國Rapidbio公司；FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品。

中醫證候判定標準脾虛證：凡具有食少納呆、體倦乏力、食后腹脹、大便異常等癥狀任意2項者，即診斷脾虛證。脾虛肝郁證：符合脾虛證診斷，并具有胸脅、少腹脹痛，噯氣、吞酸，情緒抑郁或煩躁易怒，善太息，口干苦或咽部如有物梗阻感等癥狀任意3項者，即診斷脾虛肝郁證。脾虛濕熱證：符合脾虛證診斷，并具有口渴少飲，便溏不爽，肢體困重，身熱不揚，舌質紅、苔黃膩，脈濡數等癥狀任意3項者，即診斷脾虛濕熱證。脾腎兩虛證：符合脾虛證診斷，并具有腰膝酸軟、性欲減退、畏寒肢冷、夜尿頻多、五心煩熱等癥狀任意2項者，即診斷脾腎兩虛證。

肝功能及乙肝病毒脫氧核糖核酸檢測丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶和總膽紅素檢測由上海中醫藥大學龍華醫院檢驗科完成，乙肝病毒脫氧核糖核酸由上海艾迪康醫學檢驗中心完成。

單個核細胞的分離采集患者外周血10mL，肝素抗凝，密度梯度離心法獲取單個核細胞，無血清RPMI1640懸浮沉淀細胞、計數，調整細胞濃度為2×106～6×106/mL，各組均以每孔mL，置于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中溫育2h，去除未貼壁細胞，獲得單個核細胞。

DC體外定向誘導分化和培養按照Romaru等分離培養DC的方法［7,8］，并稍作修改。單核細胞用無血清RPMI1640清洗3次，加入10%胎牛血清RPMI1640培養液，重組GMCSF100ng/mL和rhIL4100ng/mL終濃度加入細胞因子，37℃、5%CO2培養，隔日半量換液1次法檢測DC培養上清液中細胞因子IL10濃度。

統計學方法數據用x±s表示，組間率的比較采用方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異法和GameHowell法，用SPSS版軟件分析。

2結果

DC形態及增殖外周血獲取的PBMC，貼壁培養2h后，獲得的貼壁細胞為單核細胞；培養第3天，見貼壁單核細胞聚集成均勻散布的細胞聚體；培養第5天，可見部分細胞成簇、聚集樣增生，形態變為輕度不規則形；培養第7天，培養孔中可見大部分細胞懸浮不貼壁，形態不規則，倒置相差顯微鏡觀察可見伸展的大量毛刺。貼壁培養第7天，掃描電子顯微鏡觀察示細胞表面粗糙，有大量皺折和不規則突起形成典型DC形態。DC在體外經細胞因子的刺激可明顯增殖，但CHB患者DC的增殖能力較正常人低。

圖1不同貼壁培養時間的DC形態

Figure1MorphologyofDCatdifferenttimepointsafteradherentcultivation(Invertedphasecontrastmicroscopy,×200)

A:Twohoursafteradherentcultivation;B:Daythreeafteradherentcultivation;C:Dayfiveafteradherentcultivation;D:Daysevenafteradherentcultivation.

不同中醫證候分類CHB患者肝功能及HBVDNA測定不同中醫證候分類CHB患者肝功能各指標及HBVDNA載量比較，差異均無統計學意義。見表1。

不同中醫證候分類CHB患者DC表型流式細胞檢測結果顯示，不同中醫證候分類CHB患者DC表面分子CD80、CD86、CD1a表達陽性率均低于正常人群，脾虛濕熱和脾腎兩虛證患者HLADR表達陽性率亦低于正常人；其中，脾虛肝郁證患者CD80、CD1a和HLADR表達陽性率顯著高于脾腎兩虛證；脾虛濕熱證患者CD1a表達陽性率顯著高于脾腎兩虛證。見表2和圖3。【摘要】目的：研究慢性乙型肝炎患者不同脾虛兼證與外周血樹突狀細胞表型及功能的關系。方法：CHB患者60例，按中醫證候診斷標準分為脾虛肝郁、脾虛濕熱和脾腎兩虛組，每組20例，10名健康人為正常對照。分離各組外周血單個核細胞，體外誘導培養DC，流式細胞儀測定DC表型，酶聯免疫吸附檢測法測定DC分泌白細胞介素10濃度，同步檢測患者生化指標及乙肝病毒的脫氧核糖核酸水平。結果：CHB患者DC體外誘導增殖能力較正常人下降，DC成熟表面標記物顯著低于正常人。不同證候CHB患者DC表面標記物CD80、CD86和CD1a表達陽性率均低于正常人。脾虛肝郁證患者CD80、CD1a和HLADR表達陽性率顯著高于脾腎兩虛證，脾虛濕熱證患者CD1a表達陽性率顯著高于脾腎兩虛證。CHB患者DC培養上清中IL10濃度顯著高于正常人。脾腎兩虛證患者DC培養上清中IL10含量高于脾虛肝郁證。結論：在CHB發病過程中，不同脾虛兼證CHB患者DC的表型及功能間存在差異，提示中醫證候分類與機體免疫功能之間存在一定相關性。

【關鍵詞】慢性乙型肝炎;樹突狀細胞;中醫學;脾虛;證候

Objective:Tostudythephenotypesandfunctionsofdendriticcells(DCs)derivedfromperipheralbloodmonocytesofchronichepatitisB(CHB)patientswithdifferenttraditionalChinesemedicine(TCM)syndrometypes,andtoexploretherelationshipbetweenTCMsyndrometypeandDCfunctions.

Methods:SixtyCHBpatientswereincludedinthisstudy.AlltheCHBpatientsweredividedintospleendeficiencyandliverstagnation,spleendeficiencyanddampnessheatanddeficiencyofbothspleenandkidneygroupsaccordingtoTCMsyndromediagnosisstandard.Therewere20casesineachgroup,andtenhealthypeoplewereincludedasnormalcontrol.Thevolunteer’speripheralbloodwascollectedformonocyteseparation,biochemicaltestandhepatitisBvirusDNAloadsdetection.DCswereinducedandisolatedfromperipheralbloodmonocytes,andthentheexpressionsofsurfacemarkersCD80,CD86,CD1aandHLADRweredetectedbyflowcytometricanalysismethod.Interleukin10(IL10)productionoftheDCswasquantifiedbyenzymelinkedimmunosorbentassay.

Results:TheproliferationofDCsintheCHBpatientswasslowerthanthatinthehealthyvolunteers().TheexpressionsofDCsurfacemoleculessuchasCD80,CD86,andCD1awereobviouslydecreasedintheCHBpatientsascomparedwiththoseinthehealthyvolunteers().Moreover,expressionsofDCsurfacemoleculesweredifferentamongCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ThepositiveexpressionsofCD80,CD1a,andHLADRintheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnationwereobviouslyhigherthanthoseintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney(),andtheCD1aexpressionintheCHBpatientswithspleendeficiencyanddampnessheatwashigherthanthatintheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidney().InDCculturesupernatant,theIL10concentrationoftheCHBpatientswithdeficiencyofbothspleenandkidneywashigherthanthatoftheCHBpatientswithspleendeficiencyandliverstagnation(),andtheIL10concentrationsoftheCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypeswerehigherthanthatofthehealthyvolunteers().

Conclusion:DuringthepathogeniccourseofCHB,thephenotypesandfunctionsofDCsaredifferentinCHBpatientswithdifferentTCMsyndrometypes.ItsuggeststhatthereisacorrelationbetweenTCMsyndrometypeandbodyimmunityfunction.

Keywords:chronichepatitisB;dendriticcell;traditionalChinesemedicine;spleendeficiency;syndrome

外周血樹突狀細胞是人體內功能最強的抗原提呈細胞，其功能狀態直接影響細胞和體液免疫應答。研究顯示慢性乙型肝炎患者存在不同程度的免疫耐受［1,2］，特別是存在樹突狀細胞功能缺陷，而健脾類中藥可改善CHB患者樹突狀細胞功能，提高機體免疫功能［3］。以脾虛為主的不同中醫證候分類之間可能存在DC活性的差別，本研究旨在研究CHB不同中醫證候分類患者DC表型及功能差異，探討DC成熟障礙的證候生物學特點。

1資料與方法

臨床資料

研究對象健康志愿者10名，為上海中醫藥大學龍華醫院職工。CHB患者60例，來自上海中醫藥大學龍華醫院肝科2008年6～12月門診患者。其中男37例，年齡19～60歲，平均歲，病程2～20年，平均年；女23例，年齡23～59歲，平均歲，病程2～19年，平均年。

診斷標準西醫診斷標準參照2000年中華醫學會《病毒性肝炎防治方案》［4］標準。中醫證候分類標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》［5］及《中醫診斷學》5版教材［6］，以臨床表現及舌苔脈象為依據制定脾虛肝郁、脾虛濕熱和脾腎兩虛證候判別標準。入選病例半年內均未接受免疫調節治療，兩周內未接受中藥治療。

研究方法

試劑儀器雙抗培養液RPMI1640培養基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、重組人白細胞介素4購自美國Peprotech公司；熒光標記CD80FITC、CD86PE、CD1aPECY5和HLADRAPC單克隆抗體購自美國BD公司；白細胞介素10試劑盒購自美國Rapidbio公司；FACSCalibur流式細胞儀為美國BD公司產品。

中醫證候判定標準脾虛證：凡具有食少納呆、體倦乏力、食后腹脹、大便異常等癥狀任意2項者，即診斷脾虛證。脾虛肝郁證：符合脾虛證診斷，并具有胸脅、少腹脹痛，噯氣、吞酸，情緒抑郁或煩躁易怒，善太息，口干苦或咽部如有物梗阻感等癥狀任意3項者，即診斷脾虛肝郁證。脾虛濕熱證：符合脾虛證診斷，并具有口渴少飲，便溏不爽，肢體困重，身熱不揚，舌質紅、苔黃膩，脈濡數等癥狀任意3項者，即診斷脾虛濕熱證。脾腎兩虛證：符合脾虛證診斷，并具有腰膝酸軟、性欲減退、畏寒肢冷、夜尿頻多、五心煩熱等癥狀任意2項者，即診斷脾腎兩虛證。

肝功能及乙肝病毒脫氧核糖核酸檢測丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶和總膽紅素檢測由上海中醫藥大學龍華醫院檢驗科完成，乙肝病毒脫氧核糖核酸由上海艾迪康醫學檢驗中心完成。

單個核細胞的分離采集患者外周血10mL，肝素抗凝，密度梯度離心法獲取單個核細胞，無血清RPMI1640懸浮沉淀細胞、計數，調整細胞濃度為2×106～6×106/mL，各組均以每孔mL，置于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱中溫育2h，去除未貼壁細胞，獲得單個核細胞。