RNA提取及PCR相關

實驗技術目前一頁\總數五十二頁\編于十六點RNA提取逆轉錄實驗步驟結果分析PCRqPCR內容目前二頁\總數五十二頁\編于十六點從RNA提取到基因定性/定量流程收集并保存組織、血液、細胞等臨床樣本提取、純化RNA逆轉錄生成cDNAPCR/qPCR進行定性/定量分析目前三頁\總數五十二頁\編于十六點樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織：取樣離體后，立即分成1cm3左右的小塊，

每塊約30-100mg，放入凍存管或錫箔紙包好，

立即放置液氮罐中速凍1小時，-80℃冰箱保存。注意做好標記，避免反復凍融第一部分RNA提取目前四頁\總數五十二頁\編于十六點RNA提取樣本保存要求細胞：不建議保存。

培養處理后立即提取RNA， 或收集后，于Trizol液中-80℃保存。血液：不建議長期保存。

或立即分離白細胞后，于Trizol液中-80℃保存。目前五頁\總數五十二頁\編于十六點試劑耗材準備工作目的：去除RNase，防止RNA降解?各種離心管、Tip頭、冷凍保存管等塑料器皿： 浸泡在0.1%的DEPC水中，過夜處理，次日烘干， 高壓滅菌后再次烘干。?錫箔紙、玻璃勻漿管、研缽、手術剪刀、鑷子、移液管等玻璃、金屬及陶瓷制品：用錫箔紙嚴密包裹后，150℃高溫烘烤4小時。目前六頁\總數五十二頁\編于十六點前期準備工作?RNase-free水：0.1％DEPC處理去離子水過夜，次日高壓滅菌除去殘留DEPC，分裝1.5mlEppendorf管，4℃保存。?75％乙醇：用RNase-free水配制，分裝為50ml，4℃保存。?氯仿、異丙醇、無水乙醇：新包裝開封后，分裝50ml，4℃保存。注意：DEPC有吸入毒性，需穿工作服，戴手套、口罩操作。目前七頁\總數五十二頁\編于十六點樣本準備

組織

大鼠組織樣品量總RNA量（μg）腦10mg8肺10mg10腎臟10mg10心臟10mg20脾臟10mg35肝臟10mg4050－100mg組織對應1mlTrizol目前八頁\總數五十二頁\編于十六點樣本準備

細胞?懸浮細胞：生長對數期誘導后，5000×g，5min離心去 除培養基，收集約5-10×106個細胞。

每5-10×106個細胞對應1mlTrizol

?貼壁細胞：生長對數期誘導后，收集約5-10×106個細 胞，倒掉培養基，加入預熱PBS洗一次，去 除PBS。每10cm2培養面積對應1mlTrizol目前九頁\總數五十二頁\編于十六點RNA的提取注意佩戴口罩、勤更換手套

組織（1）液氮預冷研缽；（2）液氮研磨，至樣品呈粉末狀（需8-10min）；（3）向研缽內加入1mlTrizol繼續研磨，至呈不黏稠液態；（4）將混合液轉移至玻璃勻漿器中，冰上勻漿3min；（5）將勻漿液轉移至1.5mlEppendorf管，室溫孵育5min；裂解目前十頁\總數五十二頁\編于十六點目前十一頁\總數五十二頁\編于十六點RNA的提取

細胞懸浮細胞：離心收集后，倒除培養液，加入1mlTrizol反復吹打細胞，至溶液不黏稠。

貼壁細胞：倒除培養液，PBS洗滌一次后，直接在培養瓶或培養板中加入1mlTrizol反復吹打細胞，直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后，轉移至1.5mlEppendorf管裂解目前十二頁\總數五十二頁\編于十六點目前十三頁\總數五十二頁\編于十六點Trizol勻漿孵育后－80℃保存加入0.2ml氯仿，劇烈搖動15s;3minatRT,12,000gx15min,4℃分層取水相，0.5mL異丙醇，顛倒混勻，10minatRT4℃，12,000gx10min（片狀沉淀物為RNA）沉淀去上清，1ml75％乙醇洗滌，7,500gx5minat4℃，重復一次洗滌空氣干燥，加50ulRNase-free水，55℃孵育溶解干燥溶解目前十四頁\總數五十二頁\編于十六點RNA提取優化步驟（1）對得率較低的樣本，可在異丙醇沉淀一步，選用-20

度過夜孵育，以增加得率。（2）對多糖含量較高的樣本，可在異丙醇沉淀一步，加入

高鹽溶液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl），-20度過

夜共孵育，以去除多糖物質的污染。注意：所有試劑均需無酶水配制。目前十五頁\總數五十二頁\編于十六點RNA鑒定及初定量

（1）測量OD值——得率及純度檢測

得率

總RNA濃度（ug/ml）＝OD260×稀釋倍數×40ug/ml

（通常OD260數值介于0.15-1.0之間才可靠）

純度

OD260/280檢測RNA純度值在1.8-2.1之間，RNA純度較好；值小于1.8，表明蛋白雜質較多；值大于2.2，表明RNA已降解；目前十六頁\總數五十二頁\編于十六點RNA鑒定及初定量

（2）瓊脂糖凝膠電泳——RNA完整性鑒定

1－3ulRNA溶液上樣，1％膠，100V電泳10min。完整RNA呈現明顯兩條帶28S，18S，且28S帶約為18S帶亮度的兩倍；有時也可見5S帶目前十七頁\總數五十二頁\編于十六點RNA鑒定及初定量ElectrophoresisgeloftheRNAsample目前十八頁\總數五十二頁\編于十六點小結－RNA的保護1.提取前

1.1新鮮樣品及液氮速凍

1.2提取工作區RNase的清除

1.3實驗用品RNase的清除

2.提取中

2.1組織破碎過程中的保護

2.2細胞裂解過程中的保護

2.3實驗人員保護措施

2.4保存過程中3.在后續的逆轉錄過程中仍需保持無酶環境目前十九頁\總數五十二頁\編于十六點第二部分RT-PCR逆轉錄PCRreversetranscriptionAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’mRNA(sense)Antisenseprimers:oligo(dT)orrandomhexamersorGSP1ststrandcDNAAAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’PCRusingGSP+GSP1GSP1GSPGSP1(sense)GSP(antisense)1ststrandcDNA目前二十頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄?選擇方法：

兩步法（適用于多目的基因）

一步法（適用于單一目的基因）目前二十一頁\總數五十二頁\編于十六點RNA逆轉錄

?選擇逆轉錄引物：

隨機引物（適用于低豐度RNA）

Oligo(dT)引物（適用于具有PolyA尾的RNA）

特異性引物（適用于一步法）

目前二十二頁\總數五十二頁\編于十六點RNA逆轉錄步驟（1）取1-5ugRNA樣本，65℃熱變性10min；（2）配制反應體系，共20ul（以AMV為例）

10×buffer 2ul Mgcl2(25mM) 4ul dNTPs(10mM) 2ul RNaseinhibitor(1U/ul)0.5ul reversetranscriptase15U reverseprimer0.5ug RNAsample1-5ug RNase-freeWater加至20ul 一、逆轉錄反應目前二十三頁\總數五十二頁\編于十六點RNA逆轉錄步驟（3）反應體系42℃孵育60min。如使用隨機引物，先室溫孵育

10min后，再升溫至42℃。（4）72℃，5min失活酶，置冰進行后續反應或-20℃保存。cDNA第一鏈已合成，可低溫保存或繼續后續實驗目前二十四頁\總數五十二頁\編于十六點聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，以反應底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。PCR的原理和反應過程目前二十五頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄PCRPCR反應準備工作：

?目的基因擴增引物設計：NCBI中查詢靶基因的mRNA序列，無特

殊要求可選擇CDS序列作為引物設計區域。目前二十六頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄PCR?mRNA序列查找（以EGFR為例） 目前二十七頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄PCR…………目前二十八頁\總數五十二頁\編于十六點……………………目前二十九頁\總數五十二頁\編于十六點以BLAST驗證引物目前三十頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄PCRPCR反應準備工作：?選擇內參：1.受不同實驗處理因素時，表達恒定；

2.在體內各種組織中表達恒定；

3.除實驗設計處理因素之外，能夠與目的基因一起受同等程度的非設計其它因素影響。

常用內參基因名稱：β-actin、GAPDH、16Sr、18Sr

（Human、Rat、Mouse）目前三十一頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄步驟二、PCR擴增（示例）cDNA第一鏈 2ul10×PCRbuffer(K+)5ul25mMMgCl23ul(1.5mM)10mMdNTPs1ul(各200uM)50μM引物正向/反向各0.5ul(0.1~0.5uM)Taq酶 0.5ul(1~5U)雙蒸水38.5ul總反應體積：50ulPCRmix包含：buffer（Mg2+）dNTPsTaq酶目前三十二頁\總數五十二頁\編于十六點RT-PCR逆轉錄步驟PCR反應條件

95℃ 2min 95℃ 30sec 40-65℃ 10-120sec 22-35cycle 72℃ 60-120sec 72℃ 10min 12℃ ∞

退火溫度：引物的退火溫度一般要比估計的相應熔點溫度Tm低5℃左右。兩條引物的退火溫度相差不應超過4-6℃。特異性的改進：提高退火溫度（比建議退火溫度提高2-5℃）；減少退火時間。過長的退火時間在正常情況下并不能提高產量，只會增加非特異性引物雜交的可能性。目前三十三頁\總數五十二頁\編于十六點注意事項（1）每次PCR設立對照組和陰性對照組。（2）科學做法是將內參引物加入目的基因的PCR擴增 反應體系中，同時擴增作為對照。（3）將反應體系中的相同試劑預先混合，再分裝成各反應管。（4）設定合適的循環次數，PCR不能進入平臺期。（5）在一定范圍內調整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度，消除非特異性擴增。目前三十四頁\總數五十二頁\編于十六點結果鑒定

瓊脂糖凝膠電泳分析結果：

2％瓊脂糖凝膠，取4-8ul產物上樣，60V電泳40min，紫外燈下觀察結果。采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描，測定灰度值。注意：灰度掃描時，選擇合適的膠空白區域作為扣除的背景灰度值。目前三十五頁\總數五十二頁\編于十六點基因表達的差異分析－相對定量各反應體系以內參基因為參照，計算待測基因產物與其灰度比值，作為待測基因的表達值。即

待測基因產物電泳帶灰度值 內參基因產物電泳帶灰度值

雙標準曲線法： 待測樣本基因相對表達量 參照樣本基因相對表達量＝待測基因相對表達量目前三十六頁\總數五十二頁\編于十六點結果示例

目前三十七頁\總數五十二頁\編于十六點結果示例目前三十八頁\總數五十二頁\編于十六點熒光定量PCR(Real-timePCR,qPCR)PCR+熒光探針/熒光染料①應用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產物定量、基因表達研究、病原體檢測及PCR條件的優化等。②可定量原理：經激光激發后熒光量隨PCR循環而累積，從而達到定量目的。③無須凝膠電泳：只須反應管內直接檢測。④減少污染環節：全封閉反應管。⑤結果重現性好：定量動態范圍高達五個數量級。目前三十九頁\總數五十二頁\編于十六點Log[DNA]循環數線性增長期Linear平臺期Plateauy=x(1+e)n指數增長期Geometric目前四十頁\總數五十二頁\編于十六點Real-timePCR相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖起始拷貝數越高，Ct值越小；起始拷貝數越低，Ct值越大目前四十一頁\總數五十二頁\編于十六點與DNA結合時發光游離時不發光

一種DNA小溝結合染料1．SYBRGreenI熒光染料目前四十二頁\總數五十二頁\編于十六點

在PCR過程中染料與DNA結合發光聚合完成聚合開始SYBRGreenI目前四十三頁\總數五十二頁\編于十六點每形成一個DNA雙鏈，就有一定數量的染料結合上去染料一結合，就產生熒光信號信號強度與DNA分子總數目成正比數量關系目前四十四頁\總數五十二頁\編于十六點一條探針，兩條引物引物位于探針的兩邊一條探針，兩個基團前邊是報告基團，后邊是淬滅基團

3'5'RQ3'3'5'5'3'5'5'２．TaqMan探針/水解探針目前四十五頁\總數五十二頁\編于十六點每產生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產生一個單位信號信號強度與結合探針的DNA分子數成正比數量關系5’TaqMan探針上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QR目前四十六頁\總數五十二頁\編于十六點Real-timePCR反應體系cDNA第一鏈 2ul10μM引物正向/反向各1ul(0.1~0.5uM)2×SYBRGreenqPCRMix10ul雙蒸水7ul

總體積20ulSYBRGreenqPCRMix包含：SYBRGreen、buffer（Mg2+）、

dNTPs、Taq酶目前四十七頁\總數五十二頁\編于十六點Real-timePCR的定量方式絕對定量：通過定量標準曲線來確定起始模板的拷貝數；相對定量：用來確定經過不同處理的樣品目標轉錄本之間的表達差異或是目標轉錄本在不同時相的表達差異。結果分析△△Ct法：目的基因與管家基因（內參）擴增效率相同或接近一致時，采用此法。目前四十八頁\總數五十二頁\編于十六點△△Ct法舉例：測定X基因在某因子作用前后的表達變化內參基因：GAPDH;實驗分實驗組和對照組X基因Ct值（平均值）GAPDHCt值（平均值）△Ct△△Ct2－△△Ct對照組27.3516.9810.3701實驗組127.5216.8610.660