現在，研究人員開發出一種在酵母中分析這種基因功能的新方法。研究人員用一種可熱誘導的“Degron來標記一個目標蛋白，標記物使得該蛋白在37攝氏度易發生蛋白水解，而且，當一個重要蛋白在活體中被破壞時，可對由該蛋白功能損失所產生的結果進行判別。研究人員采用這種方法來篩選細胞周期演進中的缺陷，在酵母中識別出三種DNA復制因子。雙鏈RNA對基因表達的抑制及其應用細胞中存在的絕大多數RNA分子都是單鏈的，在遺傳信息傳遞及蛋白質合成過程中發揮作用。DsRNA通常是感染細胞的病毒在復制過程中RNA合成的中間產物或一些DNA序列兩條互補鏈轉錄產物相互結合的副產物。早期的研究揭示dsRNA會通過干擾素途徑誘導產生一種蛋白激酶從而抑制被感染細胞中的蛋白質合成，但并不清楚dsRNA如何影響受感染細胞的正?；虮磉_及其功能。RNAi（RNAinterference）是指外源性雙鏈RNA（dsRNA）能抑制細胞內與其序列同源的基因的表達，在進化上，這可能是生物調控基因表達及抵御病毒侵染或轉座子誘導DNA突變的一種共有的生理機制。自1998年Fire證明RNAi可被應用于研究線蟲基因的功能以來，已取得了巨大的進展。尤其是在人類及小鼠基因組計劃相繼完成，研究的重心已從大規模測序階段轉移到功能基因組的背景下，我們面臨的是如何詮釋這些遺傳信息、如何將這些序列信息與生物學功能關聯起來。而RNAi為我們研究未知功能的基因提供了新的反向遺傳學手段，同時在人類基因治療方面具有潛在的應用價值。在未知功能基因的研究中，常用的反向遺傳學手段包括基于同源重組的基因敲除及利用負鏈RNA與同源mRNA通過堿基互補結合，從而阻止其翻譯或觸發降解機制的反義RNA抑制兩種手段，并都已成功地應用于一些功能基因的研究。但這兩種方法都不能完全滿足日益增長的研究需求。如，基因敲除能從根本上消除目標基因的活性，是經典的反向遺傳學手段，但由于常規的基因敲除試驗需要：（1）構建含突變位點的目標基因載體；（2）導入胚胎干細胞（ES）細胞；（3）篩選含重組構件的ES細胞；（4）將上述ES細胞注入囊胚腔；（5）通過嵌合體F1代自交以產生帶突變純合體的F2代，這往往需要幾個月的時間，不利于在短期內研究數量較多的未知功能基因。同時，若希望一次性敲除兩個或多個基因，對于基因敲除也是一大難題。此外，若希望研究某一突變致死基因在特定胚胎發育階段的功能，基因敲除可能也無法滿足研究的需求，因為胚胎可能在早期就因為缺失此基因而死亡。在某些制造基因敲除動物模型十分困難或因倫理學原因根本就不可能進行的物種中（如大型動物及人），基因敲除也無法應用。對于反義RNA抑制手段，雖然應用于果蠅中已取得了較好的效果，但在爪蟾Xenopus）、斑馬魚（Zebrafish）及小鼠胚胎中反義RNA不能穩定可靠地降低目標基因（例如Mos，Plat）的表達。同時，由于反義RNA技術對內源性基因表達的抑制較弱，往往產生過渡性的表型，這也妨礙了我們對目標基因功能的準確判斷。RNAi可以有效地彌補基因敲除與反義RNA抑制的不足。由于RNAi作用比反義RNA技術更有效，更持久；比基因敲除更省時，可在短期內對多個基因進行研究（如探討與果蠅已知序列染色體上所有開放閱讀框相關聯的表型）；通過導入多種dsRNA，可以研究一系列基因的功能及他們之間的相互關系，特別是研究母源性mRNA對卵母細胞及胚胎后繼發育的影響具有其他方法無法比擬的優勢，因此具有廣闊的應用前景。最近，Elbashir使用21bpdsRNA避免了干擾素引起的細胞非特異性應激反應，實現了在一系列哺乳類細胞系中，包括人類Hela及胚胎性腎細胞系293中dsRNA對特定基因表達的抑制作用，進一步擴大了RNAi的應用范圍，并為利用dsRNA進行基因治療提供了實驗依據。盡管許多基因RNAi的表型與其基因敲除后的表型吻合得很好，但RNAi并不適用于所有的基因，如dsRNA對一些在神經細胞中發揮功能的基因抑制作用不明顯。同時，dsRNA會抑制細胞內所有具序列同源性的基因表達，因此與RNAi相關聯的表型可能反映了一個基因家族中幾個高度相關的基因缺失所導致的共同表型，而不僅僅是某一個特定的基因。此外，一些不相關基因也有可能因為局部序列的相似性而成為dsRNA的抑制作用對象。但上述問題都可以通過合理的dsRNA設計加以克服。此外，雖然dsRNA能有效抑制目標基因的表達，但必須意識到dsRNA的抑制作用是在轉錄后水平上實現的，并不是完全的。因此，RNAi作用后，一些基因依然可能保持低水平的基因表達。在研究未知基因的功能時必須考慮到RNAi的這些特點。問題與展望dsRNA能特異性抑制同源基因表達的發現引起了越來越多研究者的興趣。目前對于RNAi的作用機制已有了較深入的認識，但依然有許多方面尚不明了，如介導降解mRNA的核糖核蛋白復合物(RNP)的構成及其行使功能的機制，rde-1和rde-4在dsRNA降解及小片段dsRNA傳遞到RNP過程中如何行使其功能，及推測中的螺旋酶尚未得到鑒定等等。然而，這并不妨礙RNAi成為研究線蟲功能基因組的有力手段之一，并已被越來越多的實驗室應用于未知基因功能的研究。當前，人類的基因組計劃已完成，而另一個重要的模式動物-小鼠基因組計劃也即將完成，RNAi無疑可以在這些物種的大規模功能基因組的研究中發揮重要的作用。目前越來越多的基因測序工作已完成，接下來的問題是這些基因的功能是什么、不同的基因參與了哪些細胞內不同的生命過程、基因表達的調控、基因與基因產物之間的相互作用、以及相同的基因在不同的細胞內或者疾病和治療狀態下表達水平等等。因此，在人類基因組項目后，轉錄組的研究迅速受到科學家的青睞。轉錄組學(transcriptomics)就是在基因組學后新興的一門學科，即研究細胞在某一功能狀態下所含mRNA的類型與拷貝數。以DNA為模板合成RNA的轉錄過程是基因表達的第一步，也是基因表達調控的關鍵環節。所謂基因表達，是指基因攜帶的遺傳信息轉變為可辨別的表型的整個過程。轉錄組就是轉錄后的所有mRNA的總稱。與基因組不同的是，轉錄組的定義中包含了時間和空間的限定。同一細胞在不同的生長時期及生長環境下，其基因表達情況是不完全相同的。人類基因組包含有30億個堿基對，其中大約只有5萬個基因轉錄成mRNA分子，轉錄后的mRNA能被翻譯生成蛋白質的也只占整個轉錄組的40%左右。通常，同一種組織表達幾乎相同的一套基因以區別于其他組織，如：腦組織或心肌組織等分別只表達全部基因中不同的30%而顯示出組織的特異性。轉錄組譜可以提供什么條件下什么基因表達的信息，并據此推斷相應未知基因的功能，揭示特定調節基因的作用機制。通過這種基于基因表達譜的分子標簽，不僅可以辨別細胞的表型歸屬，還可以用于疾病的診斷。例如：阿爾茨海默病(Alzheimer'diseases,AD)中，出現神經原纖維纏結的大腦神經細胞基因表達譜就有別于正常神經元，當病理形態學尚未出現纖維纏結時，這種表達譜的差異即可以作為分子標志直接對該病進行診斷。同樣對那些臨床表現不明顯或者缺乏診斷金標準的疾病也具有診斷意義，如自閉癥。目前對自閉癥的診斷要靠長達十多個小時的臨床評估才能做出判斷?；A研究證實自閉癥不是由單一基因引起，而很可能是由一組不穩定的基因造成的一種多基因病變，通過比對正常人群和患者的轉錄組差異，篩選出與疾病相關的具有診斷意義的特異性表達差異，一旦這種特異的差異表達譜被建立，就可以用于自閉癥的診斷，以便能更早地，甚至可以在出現自閉癥臨床表現之前就對疾病進行診斷，并及早開始干預治療。轉錄組的研究應用于臨床的的另一個例子是可以將表面上看似相同的病癥分為多個亞型，尤其是對原發性惡性腫瘤，通過轉錄組差異表達譜的建立，可以詳細描繪出患者的生存期以及對藥物的反應等等。目前用于轉錄組數據獲得和分析的方法主要有基于雜交技術的芯片技術包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，基于序列分析的基因表達系列分析SAGE(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)和大規模平行信號測序系統MPSS(massivelyparallelsignaturesequencing,MPSS)。1991年Affymetrix公司在Southernblot基礎上，開發出世界上第一塊寡核苷酸基因芯片，自此微陣列技術(基因芯片)得到迅速發展和廣泛應用，已成為功能基因組研究中最主要的技術手段。但是芯片無法同時大量地分析組織或細胞內基因組表達的狀況，而且由于芯片技術需要準備基因探針，所以可能漏掉那些未知的、表達豐度不高的、可能是很重要的調節基因°SAGE是近年來發展的以測序為基礎的分析特定組織或細胞類型中基因群體表達狀態的一項技術。其顯著特點是快速高效地、接近完整地獲得基因組的表達信息。SAGE可以定量分析已知基因及未知基因表達情況，在疾病組織、癌細胞等差異表達譜的研究中，SAGE可以幫助獲得完整轉錄組學圖譜、發現新的基因及其功能、作用機制和通路等信息。MPSS是對SAGE的改進，它能在短時間內檢測細胞或組織內全部基因的表達情況，是功能基因組研究的有效工具。因其需要配套的軟硬件較為昂貴，目前國內外的相關應用報道不多。MPSS技術對于致病基因的識別、揭示基因在疾病中的作用、分析藥物的藥效等都非常有價值，該技術的發展將在基因組功能方面及其相關領域研究中發揮巨大的作用。功能基因篩選的基本策略功能基因篩選研究的基本策略包括:(1)通過表達譜差異分析、生物信息學分析和基因克隆等途徑獲得候選基因；(2)對候選基因進行功能評價(identificationoffunction，可在基因組、轉錄、蛋白質組和代謝產物等水平進行)；(3)基因功能確證(validationoffunction);(4)決定開發戰略。獲得候選基因的研究路線之一是通過正常和疾病組織的表達譜差異分析(expressionprofilingofnormalanddiseasedtissues)獲得疾病的相關基因，進一步進行基因功能的篩選研究。該篩選策略與疾病過程密切相關，較多地應用于新藥及治療靶點的發現。確定候選功能基因獲得候選基因的另一研究路線是通過生物信息學分析(bioinformaticanalysis)預測、選定基因序列、克隆獲得候選基因，進一步進行基因功能的篩選研究。該研究策略篩選范圍廣，多用于新基因的功能探索研究。用于生物信息學分析的數據資料，主要來源于DNA芯片技術和其他相關技術測定的基因表達信息。通過與已知基因或蛋白質序列的分析、比較可以確定候選研究基因序列長度,提供該未知基因產物信號轉導通路、細胞結構蛋白類型和細胞定位等預測信息。然而由于人類基因組中約1/3的基因序列與其他基因無同源性，因此這些基因的功能不易進行直接預測。另一方面，蛋白質的功能表現還與其所處的分子環境有關，一種蛋白質實際上與相鄰蛋白質形成了功能網絡(functionalnetworks)。因此，生物信息學中的功能網絡數據庫分析，對于了解復雜信號通路及與其他基因產物的關系，可能會提供有價值的參考信息。除上述研究策略外,其他途徑的功能基因研究也在進行，如直接從正?；蚣膊〗M織中克隆單一未知基因，進行功能研究。EST技術及其在基因全長cDNA克隆上的應用策略摘要：隨著人類基因組計劃的順利進行，EST技術被廣泛應用于基因識別、繪制基因表達圖譜、尋找新基因等研究領域。利用人類基因組研究不斷產生的數據，從ESTs即cDNA的部分序列入手，通過同源篩選，獲得基因部分乃至全長cDNA序列，避免或減輕了構建與篩選cDNA文庫等繁鎖實驗室工作。本文從原理、應用及其在科學研究上產生的影響等方面對EST技術進行了概述。表達序列標簽（expressedsequencetags,ESTs）是指從不同組織來源的cDNA序列。這一概念首次由Adams等于1991年提出。近年來由此形成的技術路線被廣泛應用于基因識別、繪制基因表達圖譜、尋找新基因等研究領域，并且取得了顯著成效。在通過mRNA差異顯示、代表性差異分析等方法獲得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全長cDNA序列，以便對該基因的功能進行研究?？寺∪LcDNA序列的傳統途徑是采用噬斑原位雜交的方法篩選cDNA文庫，或采用PCR的方法，這些方法由于工作量大、耗時、耗材等缺點已滿足不了人類基因組時代迅猛發展的要求。而隨著人類基因組計劃的開展，在基因結構、定位、表達和功能研究等方面都積累了大量的數據，如何充分利用這些已有的數據資源，加速人類基因克隆研究，同時避免重復工作，節省開支，已成為一個急迫而富有挑戰性的課題擺在我們面前，采用生物信息學方法延伸表達序列標簽（ESTs）序列，獲得基因部分乃至全長cDNAycg，將為基因克隆和表達分析提供空前的動力，并為生物信息學功能的充分發揮提供廣闊的空間。文本將就EST技術的應用并就其在基因全長cDNA克隆上的應用作一較為詳細的介紹。1、 ESTs與基因識別EST技術最常見的用途是基因識別，傳統的全基因組測序并不是發現基因最有效率的方法，這一方法顯得即昂貴又費時。因為基因組中只有2%的序列編碼蛋白質，因此一部分科學家支持首先對基因的轉錄產物進行大規模測序，即從真正編碼蛋白質的mRNA出發，構建各種cDNA文庫，并對庫中的克隆進行大規模測序。Adams等提出的表達序列標簽的概念標志著大規模cDNA測序時代的到來。雖然ESTs序列數據對不精確，精確度最高為97%，但實踐證明EST技術可大大加速新基因的發現與研究。Medzhitov等通過果蠅黑胃TOLL蛋白進行dbEST數據庫檢索，該蛋白已證實在成熟果蠅抗真菌反應中發揮重要作用，通過同源分析的方法，找到相應的人類同源EST（登錄號為H48602），這為接下來研究人類TOLL同源蛋白的功能提供了很好的條件。hMSH5基因是從釀酒酵母菌MSH5存在30%的一致性，它與hMSH4特異性相互作用，在減數分裂和精子發生過程中發揮一定的作用。由此可見，應用EST技術，可以跳過生物分類學的界限，從生物模型的已識別基因迅速克隆出人和小鼠基因組相應的更復雜的未知基因。生物間在核苷酸水平上的進貨差異阻礙了傳統意義上的雜交或以PCR為基礎的基因克隆策略，即使是親緣關系很接近的生物也不例外，如C.elegans和C.briggsae，它們僅在2?5千萬年前分化形成。而通過計算機進行dbEST進行數據庫篩選，其配制是電子雜交實驗，提供了一條更為廣泛的基因識別路線，這一路線允許基因組間存在差異，這使得基因識別與新基因克隆策略發生革命性變化，同時它也提供了一個足夠大小和復雜的基因數據庫，目前，ESTs數量正以平均每月10萬條的速度遞增。2、 ESTs和物理圖譜構建ESTs在多種以基因為基礎的人和植物基因組物理圖譜構建中扮演著重要角色。在這一應用中，從ESTs發展起來的PCR或雜交分析可用來識別YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆類型的載體，它們是構建基因組物理圖譜的基礎，將EST與基因組物理圖譜相比較即可辨認出含有剩余基因序列的基因組區間，包括調控基因表達的DNA控制元件，對這些元件進行分析就有可能獲得對基因功能的詳細了解。物理圖譜與遺傳圖譜間的相互參考，形成一個用途更廣泛的綜合資源，獲得這張綜合圖譜后，研究人員就可以孟德爾遺傳特征為基礎，將相關基因定位在基因組區間上，并且通過查詢以ESTs為基礎的藶圖譜，即可獲得這一區間上所有基因的名單。該綜合資源用途的大小取決于EST數據庫中擁有的基因數目。目前人和小鼠EST的不斷擴充使其應用更加廣泛和便捷。3、 ESTs和基因組序列注釋EST數據庫并非完美無瑕，因為ESTs不能被剪切為單列序列位點識讀，故精確度只能達到97%，另外，ESTS受制于表達傾向(expressionbias)，因為產生ESTs的cDNA是組織中豐富的mRNA以一定比例反轉錄而成，因此，表達水平很低的EST數據庫中找到，而表達量高的基因在EST數據庫中卻過量存在。雖然可在起始mRNA或由它合成雙鏈cDNA時進行富集，減小cDNA文庫，但cDNA文庫中仍存在大量高豐度的cDNA克隆。因此，一個理想的cDNA文庫必須去除或盡量消除多科信息克隆的影響，這就涉及到cDNA文庫的前加工技術；均等化(normalization)，減少與豐富編碼基因相關的cDNA數目；消減雜交(subtractivehybridization)，應用序列標記cDNA識別并去除文庫中多余的克降，這些技術的發展，使基因識別更依賴于EST技術，甚至可通過該技術獲得精確的基因組DNA序列，在華盛頓大學基因組測序中心和Sanger中心的聯合攻關下，C.elegans基因組10億個堿基對的測序工作基本完成。因此ESTs是一系列基因尋找工具中不可缺少后部分，而這些工具都是基因組序列為基礎的。EST技術關于基因組DNA序列的其他應用還包括對基因內含子、外是子排列的精確預測，選擇性接合事件的識別，反?；蚪M排列結構的識別等。4、ESTs與“電子”基因克隆利用計算機來協助克隆基因，稱為“電子"基因克隆(sillconcloning)，是與定位克隆、定位候選克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息學的方法延伸EST序列，以獲得基因部分乃至全長的cDNA序列。EST數據庫的迅速擴張，已經并將繼續導致識別與克隆新基因策略發生革命性變化。4.1EST序列的獲取利用計算機來協助克隆的第一步是必須獲得感興趣的EST，在dbEST數據庫中找出EST的最有途徑是尋找同源序列，標準：長度＞100bp，同源性50%以上、85%以下。可通過數個萬維網界而使用BLAST檢索程度實現，其中最常用的如NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的eneBank、意大利Tigem的ESTmachine(包括EST提取者和EST組裝機器)、THC(TentativeHumanConsensusSequences)數據庫、ESTBlast檢索程序 通過英國人類基因組作圖項目資源中心(HumanGenomeMappingProjectResourceCenter，HGMP—RC)服務器上訪問。然后將檢出序列組裝為重疊群contig)，以此重疊群為被檢序列，重復進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復以上過程，直到沒有更多的重疊EST檢出或者說重疊群序列不能繼續延伸，有時可獲得全長的基因編碼序列。獲得這些EST序列數據后，再與GeneBank核酸數據庫進行相似性檢測，假如鳳有精確匹配基因，將EST序列數據據EST六種閱讀框翻譯成蛋白質，接著與蛋白質序列數據庫進行比較分析?；蚍治龅慕Y果大致有三種：第一是已知基因，是研究對象為人類已鑒定和了解的基因；第二是以前未經鑒定的新基因；第三是未知基因，這部分基因之間無同種或異種基因的匹配。新基因和未知基因將進一步用于生物學研究。4.2基因的電子定位基因的電子定位采用NCBI的電子PCR程序進行檢索，尋找EST序列上是否存在序列標簽位點(sequencetaggedsites,STS)，STS作為基因組中的單拷貝序列，是新一代的遺傳標記系統，其數目多，覆蓋密度較大，達到平均每1kb一個STS或更密集。將尋找到的STS與相應的染色體相比較，即可將此序列定位在該染色體上。4.3IMAGE克隆的索取許多ESTs所對應的cDNA克隆可通過基因組及其表達的整合分子分析(intergratedmolecularanalysisofgenomesandtheirexpression,IMAGE)協定免疫索取，這與電子基因克隆相輔相成，IMAGE協定由美國LLNL國家實驗室主持，宗旨是共享排列好的cDNA文庫中的克隆重，大規模的EST測序項目如Merk&Cow公司投資的人類ESTs項目等都加入了IMAGE協定。當研究者通過另外的途徑得到基因的部分序列，并通過同源性檢索后發現該片段與加入IMAGE協定的EST序列高度同源時，便可免費索取其原始克隆，可通過美國的ATCC組織(AmericanTypeCultureCollection)索取，從而避免或減輕篩選全長基因的麻煩，以集中精力進行基因的功能研究。5、結論人類基因組計劃已進入后基因組時代，基因組學的研究從結構基因組學過渡到功能基因組學，利用結構基因組學的同存數據，充分發揮EST技術的優勢，將為大規模進行基因識別、克隆和表達分析提供空前的動力，為生物論處學功能的發揮提供廣闊的空間。傳統mRNA差異顯示技術(DDRT-PCR)和第二代差異顯示系統2006-12-1621:20真核生物中，從個體的生長、發育、衰老、死亡，到組織的分化、凋亡以及細胞對各種生物、理化因子的應答，本質上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30000個不同的基因，但在生物體內任意細胞中只有10%的基因得以表達，而這些基因的表達是按事件和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達。其包括新出現的基因表達與表達量有差異的基因表達。生物體表現出的各種特性，主要是由于基因的差異表達引起的。由于基因差異表達的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制，通過比較同一類細胞在不同生理條件下或在不同生長發育階段的基因表達差異，可為分析生命活動過程提供重要信息。研究基因差異表達的主要技術有差別雜交(篩選)(differentialhybridization)、扣除(消減)雜交(subtractivehybridizationofcDNA，SHD)、mRNA差異顯示(mRNAdifferentialdisplay，DD)、抑制消減雜交法(suppressionsubtractivehybridization，SSH)、代表性差異分析(representialdisplayanalysis，RDA)、交互扣除RNA差別顯示技術(reciprocalsubtractiondifferentialRNAdisplay)以及基因表達系列(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)分析和電子消減(electronicsubtraction)和DNA微列陣分析(DNAmicroarray)等。本文來自這里我們重點介紹傳統mRNA差異顯示技術(DDRT-PCR)和第二代差異顯示系統：限制性酶切片段差異顯示(RFDD-PCR)本文來自傳統mRNA差異顯示技術(DDRT-PCR)是根據絕大多數真核細胞mRNA3'端具有的多聚腺苷酸尾(polyA)結構，因此可用含oligo(dT)的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。該方法的創始人LiangP和PardeeA根據PolyA序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設計合成了12種下游引物，稱3'-錨定引物，其通式為5'-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內所有可能性的mRNA序列，在5'端又設計了20種10bp長的隨機引物。這樣構成的引物對進行PCR擴增能產生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數字大體涵蓋了在一定發育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。原理見下圖：本文來自雖然mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）具有很多優點:1）速度快，較易操作;2）由于PCR擴增技術的應用，使得低豐度mRNA的鑒定成為可能，且靈敏度高;3）可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異。但在實際操作中仍存在一些問題，主要表現在：1） 出現差別條帶太多,假陽性率高達70%左右，重復性差，且對高拷貝數的mRNA具很強的傾向性；2） 在有差異的顯示片段中難以知道哪個基因是已經研究過的，哪些是未知基因3） 得到的有差異的擴增條帶短，一般在110?450bp之間；4） 以poly（A）為引物的PCR擴增只適合真核生物。所以差別顯示技術自1992年建立后，一直在不斷進行著改進。第二代差異顯示系統:限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）就是一個很有效的改進。RFDD-PCR不是直接擴增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA，再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進行擴增。正是RFDD-PCR系統使用了一系列特殊接頭和引物，特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應使RFDD-PCR分析具有高度的重復性，解決了第一代差別顯示系統的重復性問題；因為RFDD-PCR技術不使用以poly（A）為引物的PCR擴增，因而該系統對原核和真核系統皆適用；在第一代的差異顯示系統中，下游引物特異性結合poly（A）尾，因此與3'端未翻譯區域相對應的差異表達序列大部分被鑒別出，而RFDD-PCR采用優先切割翻譯序列的限制性內切酶（如TaqI），因此可以優先展示編碼區，更加適合于下游功能分析；使用RFDD-PCR或得差異顯示基因后，與disployFit網絡相連后，可以確定哪個基因是已經研究過的，哪些是未知基因，對下一步研究有很好的知道意義?？傊?，RFDD-PCR中高度嚴謹的PCR可以產生結果一致的基因表達圖譜，重點放大和展示編碼區，對原核及真核RNA都有用，大大消除假陽性。原理見下圖生物學習之家基因打靶目的基因定位缺失點突變有好多?。∪绻蛄兄笇У脑?，設計針對未知基因的SiRNA，進行轉染或轉導，觀察表型，也是好辦法。要鑒定未知功能的基因可以用1突變法：將該基因敲除，看缺失什么功能，可以認為與這個功能相關，然后進行測序，與基因庫NCBI進行比對，很可能與某些已經鑒定出功能的基因相似度高，進一步確定其功能?；蚍蛛x克隆的方法1基因芯片技術分離目的基因生物芯片是高密度固定在固相支持介質上的生物信息分子的微列陣。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，并按預先設定好的順序點陣?；蛐酒巧镄酒囊环N，其上固定的是核算類物質，主要用于DNA、RNA分析。分為DNA芯片和微點陣兩種。分離目的基因是是指從基因組中發現或找出某個目的（標）基因。目前是通過①比較不同物種之間，或同一物種不同個體之間；或同一個體在不同生長發育是期或不同環境條件下基因差異表達（基因表達平行分析）來實現的。采用基因芯片技術進行基因差異表達研究可以通過雜交直接檢測到細胞中mRNA的種類及豐度，與傳統的差異顯示相比具有樣品用量小，自動化程度高，被檢測目標DNA密度大及并行種類多等優點。②利用同源探針從cDNA或EST微列陣中篩選分離目的基因。目前有DNA芯片、cDNA芯片兩種。其基本步驟包括：基因芯片的制備、靶樣品制備、雜交與檢測、目的基因得分離并獲得全長。2基因文庫技術分離目的基因基因文庫指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體的形式出現。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉化宿主細胞，轉化細胞在選擇培養基上生長出的單個菌落（或噬菌斑，或成活細胞）即為一個DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。其類型很多，如可分為基因組文庫與cDNA文庫、克隆文庫與表達文庫，按載體分有智力文庫、噬菌體文庫、黏粒載體文庫、人工染色體文庫等?；蛭膸鞓嫿ê?，從文庫中篩選基因的方法主要有以下幾種：核算雜交法、免疫學檢測法、DNA同胞選擇法、PCR篩選法等?；蛭膸斓臉嫿ㄊ悄壳盎蚬こ痰暮诵墓ぷ鳎彩欠蛛x目的進的常用方法之一。3功能蛋白組分離目的基因蛋白組是指細胞內全部蛋白的存在及活動方式，即基因組表達產生的總蛋白質的統稱。功能蛋白質組指那些可能涉及到特定功能機理的蛋白質群體。主要研究方法為蛋白質雙向電泳。通過高效液相色譜、質普對蛋白質序列進行分析，在借用分子生物學的手段則可以進行目的基因的分離。如：應用PCR進行分離目的基因：通過對蛋白質的序列分析，可以通過密碼子的簡并性設計簡并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全長；應用核算雜交篩選法分離目的基因：即利用簡并寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫；免疫雪篩選法分離目的基因：是通過蛋白的特異抗體與目的蛋白的專一結合，從表達文庫中分離目的基因的蛋白基因。PCR技術在基因克隆中的應用PCR技術已經滲透到生物學的各個領域，在分子克隆和獲得cDNA全長方面起著重要的作用。利用PCR技術對特定條件下基因的表達進行檢測即通過mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因；通過RT-PCR克隆到目的基因的cDNA區域進行cDNA文庫的構建，通過錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調控區等。現在可用于基因分離和克隆的PCR方法主要有:RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小節），用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及減法cDNA文庫的PCR法構建等°Panhankle-PCR、Cassette-PCR為基因組已知DNA相臨未知序列的克隆奠定了良好的基礎。mRNA差別顯示技術分離差別表達基因mRNA差異顯示技術是對組織特異性表達基因進行分離的一種快速行之有效的方法之一。它是將mRNA反轉錄與PCR技術結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術。它利用5’錨定引物oligo（dT）12MN和3’端隨機引物對總mRNA進行PCR擴增，以期得到差異表達的條帶。并對其差異顯示的條帶進行回收、克隆。6插入突變分離克隆目的基因獲得突變體進行未知基因的克隆是常用的方法之一。這里舉「DNA標簽法和轉座子誘變分離克隆目的基因的例子J-DNA標簽法是將「DNA在任何感興趣的基因處產生插入性突變，獲得分析該基因功能的對照突變體。它將「DNA左右邊界之間攜帶的外源報告基因片段作為一個選擇性的遺傳標記，因為插入的序列是已知的，因而對獲得的轉基因重組突變體就可以通過各種克隆和PCR策略加以研究。倘若將35S強啟動子在T-DNA整合到宿主基因組后，整合到內原基因的上游，則可以產生異常增加或表達的時空特異性改變而破壞基因的表達的效果。有獲得性突變和功能喪失性突變等。轉座子標簽法是將一株攜帶有功能性轉座系