微生物檢驗專題知識講座微生物檢驗專題知識講座第1頁主要內容第一節核酸探針技術檢測食品微生物（第六章p108）第二節PCR技術檢測食品微生物（第七章p121）第三節環介導等溫擴增技術檢測食品微生物（第八章p161）第四節基因芯片技術檢測食品微生物（第九章p172）微生物檢驗專題知識講座第2頁第一節核酸探針技術檢測食品微生物一、探針定義定義：探針(probe)，是指與特定靶分子發生特異性相互作用，并可被特殊方法探知分子。類型：抗體-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體

核酸探針：是指帶有標識物已知序列核酸片段，它能和與其互補核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列檢測。

微生物檢驗專題知識講座第3頁二、核酸探針工作原理

兩條堿基互補DNA鏈在適當條件下按堿基配對標準形成雜交DNA分子。依據DNA遺傳序列相對穩定性和互補標準，用已知特異堿基序列作成有標識一小段單鏈(或核苷酸序列)與被檢測材料進行分子雜交。假如被檢測材料中病原遺傳序列與探針含有互補堿基序列，就會形成雜交雙鏈，從而證實它們之間含有一定程度同源性。（p108）微生物檢驗專題知識講座第4頁微生物檢驗專題知識講座第5頁三、核酸探針種類（一）按起源及性質劃分1.基因組DNA探針2.cDNA探針3.RNA探針4.寡核苷酸探針（二）按標識物劃分1.放射性標識探針：用放射性同位素做為標識物2.非放射性標識探針：生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。微生物檢驗專題知識講座第6頁四、核酸探針制備方法（略p109）（一）探針制備要求：長度普通以50~300bp為宜。制備方法：

(1)DNA重組技術

(2)PCR擴增

(3)化學合成微生物檢驗專題知識講座第7頁四、核酸探針制備方法（二）核酸探針標識方法（略p109）1.核酸探針放射性同位素標識（1）缺口平移法（2）末端標識法（3）應用特異單引物法標識DNA探針2.核酸探針非放射性標識法

（1）核酸探針生物素標識（2）核酸探針地高辛標識（3）核酸探針光敏DNP標識（4）核酸探針三硝基苯磺酸（TNBS）標識（5）核酸探針辣根過氧化物酶標識微生物檢驗專題知識講座第8頁四、核酸探針制備方法理想標識物（核酸探針）應滿足：(1)標識前后探針基礎結構、化學性質相同;(2)特異性強、本底低、重復性好；(3)操作簡單、節時；(4)安全、無環境污染。微生物檢驗專題知識講座第9頁五、核酸探針雜交方法分子雜交：把親源關系較近，不一樣生物個體起源變性DNA或RNA單鏈，經退火處理形成DNA-DNA或DNA-RNA這一過程叫分子雜交。應用：(1)檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系；(2)用來揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷貝數及表示豐度。微生物檢驗專題知識講座第10頁微生物檢驗專題知識講座第11頁雜交類型（1）按雜交對象：DNA-DNARNA-DNA（2）按作用環境：固相雜交：是將參加反應一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸（標識探針）游離在溶液中。液相雜交：所參加反應兩條核酸鏈都游離在溶液中微生物檢驗專題知識講座第12頁（一）印跡雜交基礎過程：第一，經過印跡技術將核酸片段轉移到固相支持物（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上；第二，用標識探針與支持物上核酸片段進行雜交；第三，雜交信號檢測。主要類型：斑點印跡雜交(Dot-blot)Southern印跡(Southernblot)Northern印跡(Northernblot)微生物檢驗專題知識講座第13頁1.Southern印跡法Southern印跡法(Southernblotting)是最早DNA探針雜交技術，1975年，由英國分子生物學家E.M.Southern所創造。就是將凝膠上DNA片段轉移到硝酸纖維素濾膜上后，在進行雜交。被檢測對象為DNA

微生物檢驗專題知識講座第14頁

Southern印跡操作方法有三種①毛細管轉移(或虹吸印跡)

進行毛細管轉移時，DNA片段由液流攜帶從凝膠轉移到固相支持物表面。②電轉移利用電場電泳作用將凝膠中DNA轉移到固相支持物上，可到達簡單、快速、高效目標。③真空印跡法利用真空作用將轉膜緩沖液從凝膠上層容器抽到下層，凝膠中核酸片段將隨緩沖液移置到凝膠下面固相支持物上。微生物檢驗專題知識講座第15頁微生物檢驗專題知識講座第16頁2.Northern印跡法Northern（Northernblotting）印跡雜交技術是1979年，J.C.Alwine發展出來一個新方法檢測目標RNA存在是否及含量。是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上過程

微生物檢驗專題知識講座第17頁Northern印跡方法與Southern印跡基礎相同，可參考進行。但RNA變性方法與DNA不一樣。DNA樣品可先經過凝膠電泳進行分離，再用堿處理凝膠使DNA變性。而RNA不能用堿變性,因為堿會造成RNA水解。所以，在Northern印跡前，須進行RNA變性電泳，在電泳過程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進行印跡轉移。微生物檢驗專題知識講座第18頁3.斑點雜交將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。為使核酸牢靠結合在膜上，通常還將點樣后膜進行80℃真空烘烤2h。特點：可在一張膜上同時進行多個樣品檢測，操作簡便、快速，在臨床診療中應用較廣。適用范圍：特定基因定性及定量研究，微生物檢驗專題知識講座第19頁（二）原位雜交用探針對細胞或組織切片中核酸雜交并進行檢測方法稱之為核酸原位雜交特點是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定細胞代替純化核酸，然后將載玻片浸入溶有探針溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內。微生物檢驗專題知識講座第20頁檢測特定生物有機體之間是否存在親緣關系1.待檢菌株DNA雙鏈2.用堿或熱變性使雙鏈解開 （DNA變性）3.將單鏈DNA在硝酸纖維素膜上固定

4.加放射性標識DNA或RNA5.保溫（普通是66℃，24h）進行互補堿基配對（雜交）6.用緩沖溶液洗脫未雜交個別7.測定膜放射性，計算雜交率微生物檢驗專題知識講座第21頁關鍵：固定、沖洗。雜交率=

標識參考菌株DNA與待測菌株DNA雜交分子放射性計數×100%

標識參考菌株DNA與未標識參考菌株DNA雜交分子放射性計數微生物檢驗專題知識講座第22頁（三）結果判斷：雜交率＞75%，高重組表示兩分子差異小。雜交率＜25%，低重組表示兩分子不相關雜交率＞60%，認為是同一個種雜交率60~70%，是同一個種中不一樣亞種雜交率70%，以上是同一亞種不一樣菌株雜交率20%以下，應考慮是不一樣屬菌株微生物檢驗專題知識講座第23頁DNA-DNA主要判別同一科中種屬間菌株DNA-RNA主要判別不一樣科菌株，因其DNA-DNA雜交率=0微生物檢驗專題知識講座第24頁金黃色葡萄球菌檢驗金黃色葡萄球菌能產生各種與毒力和致病力相關毒素和酶,其中由nuc基因編碼耐熱核酸酶（Thermostablenuclease,Thermonuclease),不但為金黃色葡萄球菌所特有,而且在不一樣菌株之間含有較高保守性[5]。可依據已經發表金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶ｎｕｃ基因序列設計引物,用ＰＣＲ技術從金黃色葡萄球菌菌株中擴增ｎｕｃ基因特異片段,經生物素標識作為核酸探針,建立了斑點雜交試驗,能夠從試驗動物及其組織中快速、敏感、特異地檢測出金黃色葡萄球菌。微生物檢驗專題知識講座第25頁探針檢測技術中存在問題1.存在假陽性和假陰性問題。2.DNA探針還不能完全取得常規檢驗提供細菌特征信息，3.檢測食品時，樣品中待檢菌量低雜質成份復雜，樣品DNA純度不夠高等都會限制探針檢測敏感性。4.不能檢測基因序列表示產物，所以在評價食品安全衛生上存在一定不足。微生物檢驗專題知識講座第26頁六、分子信標技術檢測微生物

1996年Tyagi和Kramer報道了一個含有發夾結構新型熒光核酸探針——分子信標(molecularbeacon)。微生物檢驗專題知識講座第27頁（一）基礎原理

分子信標技術是基于熒光共振能量轉移(ＦＲＥＴ)設計一段與特定核酸互補寡聚核苷酸探針，空間結構上呈莖環結構，其中環序列是與靶核酸互補探針；莖一端連接上一個熒光分子，另一端連上一個淬滅分子。當靶序列不存在時,分子信標呈莖環結構,莖部熒光分子與淬滅分子非常靠近(7～10ｎｍ)，可發生ＦＲＥＴ，即熒光分子發出熒光被淬滅分子吸收并以熱形式散發，此時檢測不到熒光信號；當有靶序列存在時，分子信標環序列與靶序列特異性結合，形成穩定雙鏈體比分子信標莖環結構更穩定，熒光分子與淬滅分子分開，此時熒光分子發出熒光不能被淬滅分子吸收，可檢測到熒光。微生物檢驗專題知識講座第28頁（二）分子信標結構

(1)環狀區，普通為長度15～30堿基序列，能與目標分子特異結合；(2)信標莖干區，通常為長度5～8堿基互補序列，莖干區與雜交后環狀區-目標分子雙鏈結構之間熱力學平衡關系，使分子信標雜交特異性顯著高于常規線狀探針；(3)熒光基團和猝滅基團，熒光基團普通聯接在信標分子5’-端；微生物檢驗專題知識講座第29頁（三）分子信標檢測特點

1.能夠進行液相雜交檢測2.有效消除核酸交叉污染3.可進行核酸實時檢測4.特異性強5.靈敏度高6.可實現核酸大規模自動化檢測7.可對活體內核酸動態進行檢測微生物檢驗專題知識講座第30頁應用

分子信標用于核酸檢測分析1.實時定量PCR測定靶標濃度2.分子信標用于活體內核酸動態檢測3.利用多色分子信標對多個靶核苷酸同時定量檢測4.分子信標用于檢測雙鏈DNA

分子信標用于研究DNA-蛋白質相互作用1分子信標用于核酸酶研究2.分子信標用于非特異性單鏈DNA結合蛋白研究3.分子信標用于蛋白質直接檢測依據分子信標原理,NobukoHama分子信標用作生物芯片和生物傳感器探針利用

微生物檢驗專題知識講座第31頁第二節PCR技術檢測微生物微生物檢驗專題知識講座第32頁一、PCR反應基礎原理

聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction,PCR)就是模板DNA、引物以及四種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化作用下所發生酶促聚合反應，PCR反應是由變性--退火--延伸三個基礎反應步驟組成。微生物檢驗專題知識講座第33頁PCR技術簡史DNA復制核酸體外擴增構想聚合酶鏈反應創造1971年，Khorana提出：經過DNA變性，與適當引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不停重復該過程便可克隆tRNA基因。但因為測序和引物合成困難，以及70年代基因工程技術創造使克隆基因成為可能，所以，Khorana構想被大家遺忘了……微生物檢驗專題知識講座第34頁（一）PCR技術簡史DNA復制核酸體外擴增構想聚合酶鏈反應創造1985年，美國PE-Cetus企業Mullis等人創造了聚合酶鏈反應（PCR）基礎原理是在試管中模擬細胞內DNA復制最初采取E-coliDNA聚合酶進行PCR，因為該酶不耐熱，使這一過程耗時，費勁，且易犯錯耐熱DNA聚合酶應用使得PCR能高效率進行，隨即PE-Cetus企業推出了第一臺PCR自動化熱循環儀1993年，Mullis等所以項技術獲諾貝爾化學獎微生物檢驗專題知識講座第35頁（二）PCR基礎原理PCR反應條件PCR過程PCR特點標準PCR反應體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L微生物檢驗專題知識講座第36頁基礎步驟1、變性(Denaturation)模板雙鏈DNA加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成DNA雙鏈兩條鏈堿基對之間氫鍵破裂，雙螺旋解開，使之成為單鏈，方便它與引物結合，為下輪反應作準備,這一過程咱們稱之為變性。微生物檢驗專題知識講座第37頁2、退火(Annealing)模板DNA經加熱變性成單鏈后，當溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈互補序列配對結合；咱們把這一過程稱之為退火。微生物檢驗專題知識講座第38頁3、延伸(Extension)在適宜溫度下，DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTPs為反應原料，靶序列為模板，發生酶促聚合反應，咱們把這一過程稱之為延伸。延伸時是按照堿基互補配正確標準與，從而合成了一條新與模板DNA鏈互補半保留復制鏈。微生物檢驗專題知識講座第39頁所以重復循環變性--退火--延伸這三個過程，就可取得更多“半保留復制鏈”，而且這些新合成鏈又能夠成為下次循環模板。PCR反應最終結果是，經過n次循環之后，反應混合物中所含有雙鏈DNA分子數，即兩條引物結合位點之間DNA區段拷貝數，在理論上最高值應該是2n。而每完成一次循環大約需要2～4分鐘，所以，2～3小時就能將待擴增目標基因擴增放大幾百萬倍。微生物檢驗專題知識講座第40頁微生物檢驗專題知識講座第41頁（三）PCR特點PR反應條件PCR過程PCR特點特異性強

1.引物與模板DNA特異、正確結合；

2.堿基配對標準；（A和T,G和C配對）

3.TaqDNA聚合酶合成反應忠實性；

4.靶基因特異性與保守性。靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測靈敏度可達3個RFU細菌檢測最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物普通用電泳分析微生物檢驗專題知識講座第42頁（三）PCR特點PR反應條件PCR過程PCR特點能夠擴增RNA或cDNA

用一小段寡核苷酸引物和逆轉錄酶將mRNA逆轉錄成主鏈cDNA，再將得到cDNA進行PCR擴增對標本純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等組織粗提DNAPCR技術含有一定程度錯誤滲透

核苷酸錯誤滲透幾率大約是每2×109個核苷酸中錯誤滲透一個核苷酸微生物檢驗專題知識講座第43頁PCR反應應用1、在法醫判定上應用；2、在親子判定上應用；3、在古生物學中應用；4、在生態學研究中應用；

5、在食品中有害微生物檢測應用微生物檢驗專題知識講座第44頁二、PCR反應體系一個標準PCR反應反應體系為：10×擴增緩沖液10uL

4種dNTP混合物200umol/L

引物1umol/L模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100uLPCR反應體系五個要素：PCR擴增所需引物（primer）、TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）、4種dNTP混合物（dNTPs）（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、模板（template）和緩沖液。

微生物檢驗專題知識講座第45頁（一）引物PCR擴增引物是指與待擴增靶DNA區段兩端序列互補人工合成寡核苷酸短片段。包含正向引物（ForwardPrimer）和反向引物（BackwardPrimer/ReversePrimer）。（1）引物設計軟件和引物合成能夠在線設計引物，比如etPrimer；也能夠使用PrimerPremier5.0和Oligo6.22、DNAMAN等設計軟件。設計好引物則完全由專業引物合成企業來進行合成。微生物檢驗專題知識講座第46頁（2）引物設計標準1）引物長度（primerlength）2）產物長度（productlength）3）引物及產物GC含量（composition）4）序列Tm值(meltingtemperature)5）ΔG值(internalstability)6）引物二聚體及發夾結構（duplexformationandhairpin）7）錯誤引發位點（falseprimingsite）8）對引物進行修飾，比如在引物5’末端添加限制性酶切位點9）有時候，在設計引物時僅了解有限序列信息。比如僅知道氨基酸序列，這時咱們能夠設計簡并引物。10)引物特異性：設計好引物應該含有很好特異性即設計出引物應與核酸序列數據庫中其它序列無顯著同源性。微生物檢驗專題知識講座第47頁（二）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶發覺是促進ＰＣＲ反應自動化一個關鍵原因。在PCR反應體系中用熱穩定性TaqDNA聚合酶代替DNA聚合酶ＩKlenow大片段當前主要有兩種TaqDNA聚合酶供給，一個是從棲熱水生桿菌中分離提純天然酶，另一個是大腸桿菌合成基因工程酶。催化一個經典PCR反應，普通加入酶量為2-4U，通常約需加入酶量為2.5U(指總反應體系體積為100ul時)，微生物檢驗專題知識講座第48頁（三）dNTPPCR反應體系中需要4種脫氧核苷三磷酸（dNTPs）包含：脫氧腺苷三磷酸（dATP）、脫氧胞苷三磷酸（dCTP）、脫氧鳥苷三磷酸（dGTP）、脫氧核糖胸腺嘧啶三磷酸（dTTP）。它們提供靶DNA序列擴增原料。在PCR反應中，dNTPs濃度普通為50～200umol/L，高濃度dNTPs會對擴增反應起抑制作用，濃度過低又會降低PCR產物產量。需要注意是4種dNTP濃度要相等(等摩爾配制)。微生物檢驗專題知識講座第49頁（四）緩沖液

在PCR反應體系中，普通提議用10-50mmol/LTris-HCL作為緩沖液（20℃時，pH值為8.3-8.8）。反應體系中鎂離子（Mg2+）濃度對PCR反應影響：影響DNA聚合酶活性；影響引物退火普通來說，當游離鎂離子濃度較高時，能夠增加PCR反應產量，不過同時也會增加非特異性擴增幾率，降低PCR反應特異性；反之，當游離鎂離子濃度較低時，會降低PCR反應產量。微生物檢驗專題知識講座第50頁（五）模板模板制備是PCR反應起始步驟幾個常見純化方法(1).濃鹽法利用RNP（核糖核蛋白）和DNP（脫氧核糖核蛋白）在電解溶液中溶解度不一樣，將二者分離，微生物檢驗專題知識講座第51頁（2）.陰離子去污劑法:用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性,能夠直接從生物材料中提取DNA.因為細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常見陰離子去污劑提取DNA.（3）.苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase降解作用.用苯酚處理勻漿液時,因為蛋白與DNA聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相同相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，屢次重復操作，再合并含DNA水相，利用核酸不溶于醇性質，用乙醇沉淀DNA。此時DNA是十分粘稠物質，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法特點是使提取DNA保持天然狀態.（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水性質,將組織細胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后搜集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調整至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,馬上用攪拌法攪出.然后分別用66%?80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最終在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取DNA中蛋白質含量較高,故普通不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.微生物檢驗專題知識講座第52頁三、PCR反應參數（一）變性經典變性條件是在95℃溫度下30s。變性步驟應該高溫、短時。假如變性溫度過高、時間過長，會加緊DNA聚合酶失活；變性溫度很低，會造成解鏈不完全。

微生物檢驗專題知識講座第53頁（二）退火

溫度快速冷卻至40℃～60℃，雙鏈模板DNA或經PCR擴增形成雙鏈DNA經加熱變性成為單鏈后，引物與單鏈模板DNA互補序列配對結合引物長度、堿基組成及其在反應體系中濃度決定了引物退火時間與溫度，靶基因序列長度也與退火溫度與時間相關。復性時間30～60秒足以使引物與模板之間完全結合。普通退火溫度設定比擴增引物熔解溫度（Tm值）低5℃左右。選擇較高退火溫度會大大降低引物二聚體和引物和模板間非特異性結合。微生物檢驗專題知識講座第54頁（三）延伸引物延伸溫度取決于DNA聚合酶最適溫度。。PCR反應延伸溫度普通選擇在70～75℃之間，常見溫度為72℃，此靠近于TaqDNA聚合酶最適反應溫度75℃。延伸反應時間則取決于待擴增片段長度、濃度和延伸溫度。延伸反應時間則取決于待擴增片段長度、濃度和延伸溫度。延伸時間越長，非特異性擴增帶出現機率就越大。微生物檢驗專題知識講座第55頁（四）PCR循環次數PCR反應擴增程度由循環次數決定。當PCR反應其它各項參數都確定之后,PCR反應循環次數主要取決于模板DNA起始濃度。靶分子數適宜循環次數3×10525-301.5×10430-351×10335-405040-45微生物檢驗專題知識講座第56頁普通而言，PCR適宜循環次數為25-30輪。循環次數過多,會使PCR產物中非特異性擴增產物大量增加；循環次數過少，會降低PCR擴增產量。微生物檢驗專題知識講座第57頁四、PCR擴增產物判定（一）瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠（EB）在紫外光照射下能發射出熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中溴化乙錠（EB）就會插入到DNA分子中形成熒光絡合物，從而使DNA分子發射熒光比最初增強了好幾倍。因為DNA分子發射熒光強度和樣品中DNA含量是成正比，所以當用已知濃度標準樣品作為瓊脂糖凝膠電泳對照時，就能夠比較出待測樣品濃度。微生物檢驗專題知識講座第58頁匯報結果依據引物位置可知目標擴增產物大小為279bp，所以咱們能夠依據PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠上是否形成279bp條帶來判斷擴增是否發生。假如PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠279bp位置有條帶，證實乳品中有金黃色葡萄球菌存在。（以下列圖）圖中最右邊為DNAMarkerDL，然后從右往左依次為陽性對照。陰性對照和擴增產物。假如PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠279bp位置處沒有形成條帶，就證實檢測乳品中不存在金黃色葡萄球菌。←279bp微生物檢驗專題知識講座第59頁（二）免疫檢測

免疫檢測方法是一個ELISA方法，它能快速、靈敏和特異地檢測PCR產物。基礎原理：SHARP信號系統是指首先用一個用生物素修飾引物和一個非修飾引物進行PCR擴增。擴增結束后，讓一個別反應混合物在變性劑作用下先變性，然后在溶液中加入能與之互補配正確非標識RNA探針進行雜交，得到RNA：DNA雜合體。然后用捕捉板對生物素化RNA：DNA雜合體進行捕捉。最終用對生物素化RNA：DNA雜合體特異結合堿性磷酸酯酶抗體進行檢測，讀取在405nm時吸光度。微生物檢驗專題知識講座第60頁準備探針混合物↓取50μl樣品稀釋液加到雜交管中↓在每個雜交管中加入25μl變性劑↓取5μl樣品或對照加到每個管中，1000r/min搖30秒↓室溫孵育10分鐘↓取25μl探針混合物加到每個管中↓室溫搖30秒↓65℃水浴溫育30分鐘↓從雜交管轉移到捕捉板微孔中↓捕捉板在25℃搖30分鐘（準備洗滌緩沖液）↓倒掉捕捉板中液體并用吸水紙吸干，然后在每個微孔中加100μl檢測試劑↓蓋上捕捉板，并在25℃搖30分鐘↓倒掉捕捉板中液體，并用洗滌緩沖液沖洗捕捉板5次，再用去離子水沖洗捕捉板1次↓在捕捉板每個微孔中加100μl底物，蓋上捕捉板，并在37℃孵育1小時↓在405nm讀取吸光度圖7-5SHARP信號系統檢測基礎步驟微生物檢驗專題知識講座第61頁1）不對稱PCR

目標：擴增產生特異長度單鏈DNA。方法：采取兩種不一樣濃度引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最正確百分比普通是0.01∶0.5μM,關鍵是限制性引物絕對量。用途：制備核酸序列測定模板制備雜交探針基因組DNA結構功效研究PCR種類微生物檢驗專題知識講座第62頁2)反向PCR(reversePCR)

是用反向互補引物來擴增兩引物以外DNA片段對某個已知DNA片段兩側未知序列進行擴增。可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段序列；用于僅知個別序列全長cDNA克隆,擴增基因文庫插入DNA；建立基因組步移文庫。已知序列未知序列未知序列PCR種類微生物檢驗專題知識講座第63頁3）多重PCR用于檢測特定基因序列存在或缺失。電泳引物微生物檢驗專題知識講座第64頁4）LP-PCR（Labelledprimers)

利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標識，用以直觀地檢測目標基因。尤其適合大量臨床標本基因診療可同時檢測各種基因成份病毒1病毒2病毒3病毒4微生物檢驗專題知識講座第65頁7）原位ＰＣＲ

原位聚合酶鏈式反應（InStillPCR，Is－PCR）是由Haase等于1990年首創。它是利用完整細胞作為一個微小反應體系來擴增細胞內目標片段，在不破壞細胞前提下，利用一些特定檢測伎倆來檢測細胞內擴增產物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行ＰＣＲ擴增。可進行細胞內定位。適合用于檢測病理切片中含量較少靶序列微生物檢驗專題知識講座第66頁8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增微生物檢驗專題知識講座第67頁實時PCR技術原理微生物檢驗專題知識講座第68頁應用PCR技術檢測乳品中金黃色葡萄球菌試驗器材及試劑1、試驗器材：PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統2、試驗試劑:10×PCRbuffer、dNTPs、TaKaRaTaq、DNAMarkerDL.溶葡萄球菌酶、無水乙醇、石油醚、氯仿、氨水、糖原、引物（正向引物5’-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3’，反向引物5’-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3’）。操作步驟利用PCR技術從乳品中直接檢測金黃色葡萄球菌，其操作方法以下。微生物檢驗專題知識講座第69頁1、DNA模板制備詳細步驟以下：（1）、將1ml無水乙醇、1ml氨水和1ml石油醚分別加入到5ml待檢測乳品中，并混勻。（2）、混合物以12000×g，離心10min。棄去上清液，沉淀用300ul10mmo1L-1TE(pH7.8)溶解后，加入5ul10mg.ml-1溶葡萄球菌酶，37℃溫育1h,期間不停猛烈振蕩。然后加入50ul10%SDS,煮沸5min。（3）、將等體積氯仿加入上述混合液中，充分振蕩混勻，17000×g離心10min，棄沉淀，保留上清液。(4)將上清液移入一新離心管中，用0.1倍體積2.5mo1.L-1乙酸銨(pH5.4)，2.5倍體積預冷無水乙醇和5ul10mg.ml-1糖原沉淀DNA,混合物17000×g，離心20min。DNA沉淀干燥后用100ul滅菌雙蒸水溶解，備用。微生物檢驗專題知識講座第70頁2、配置反應體系總反應體系為50ul，其中包含5ul10×PCRbuffer、4uldNTPs混合物，0.5ul40umol正向引物，0.5ul40umol反向引物，0.25ul（5U/ul）Taq，模板2ul，水37.75ul。微生物檢驗專題知識講座第71頁3、PCR擴增PCR擴增反應采取冷開啟。94℃預變性4min，再按94℃1min→52℃0.5min→72℃1.5min進行35個循環，最終72℃延伸3.5min.4、PCR擴增產物檢測取5ulPCR產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，利用凝膠成像系統觀察結果并成像。微生物檢驗專題知識講座第72頁匯報結果依據引物位置可知目標擴增產物大小為279bp，所以咱們能夠依據PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠上是否形成279bp條帶來判斷擴增是否發生。假如PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠279bp位置有條帶，證實乳品中有金黃色葡萄球菌存在。（以下列圖）圖中最右邊為DNAMarkerDL，然后從右往左依次為陽性對照。陰性對照和擴增產物。假如PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠279bp位置處沒有形成條帶，就證實檢測乳品中不存在金黃色葡萄球菌。←279bp微生物檢驗專題知識講座第73頁第三節環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增技術（Loop-mediatedIsothermalAmplification，簡稱LAMP），是年由日本榮研株式會Notomi等人開發出來，該方法一經報道就受到各國學者廣泛關注。我國對LAMP法研究起步相對較晚，~年，北京奶牛中心首次引用LAMP法進行牛胚胎性別判定。年新疆農業大學吳陽升等人應用LAMP法對牛胚胎性別進行判定。年廣州中醫藥大學李青雅等人采取LAMP法檢測乙型肝炎病毒（HBV-DNA）。微生物檢驗專題知識講座第74頁LAMP法特點1.不需要特殊試劑，不需要預先進行雙鏈DNA變性。只需要保持一個恒定溫度就能擴增反應2.特異性強。LAMP反應是針對模板六個區段，設計四條引物，而且這六個區段次序也有要求。3、能夠快速、高效地進行擴增4、靈敏度高，擴增模板可達10拷貝亦或更少。5、擴增RNA只要在DNA基因擴增試劑基礎上加上逆轉錄酶，就能夠一步實現RNA擴增。6、判定簡便。7、經濟性強。微生物檢驗專題知識講座第75頁LAMP法引物四條引物分別是：引物FIP（ForwardInnerPrimer,正向內引物）：它是由F2區段（與靶基因3’端F2c區段完全互補）和F1c區段（與靶基因3’端F1c序列完全相同）組成。其中F2區段位于FIP3’端，而F1c區段位于FIP5’端。引物F3（ForwardouterPrimer,正向外引物）：它是由F3區段組成。（與靶基因3’端F3c區段完全互補）。引物BIP（BackwardInnerPrimer,反向內引物）：它是由B2區段（與靶基因3’端B2c區段完全互補）和B1c區段（與靶基因3’端B1c序列完全相同）組成。其中B2區段位于BIP3’端，而B1c區段位于BIP5’端。引物B3（BackwardouterPrimer,反向外引物）：它是由B3區段組成。（與靶基因3’端B3c區段完全互補）。

微生物檢驗專題知識講座第76頁LAMP法基礎原理第一步：在65℃左右，模板DNA雙鏈處于動態平衡狀態，此時正向內引物FIPF2區段和目標序列上F2c互補配對，并在鏈置換型DNA聚合酶（BstDNApolymerase）作用下，以F2區段3’末端為起點，開啟鏈置換DNA合成。微生物檢驗專題知識講座第77頁第二步：以正向內引物FIPF2區段3’端為起點，經過含有鏈置換活性DNA聚合酶作用，合成了模板DNA互補鏈。微生物檢驗專題知識講座第78頁第三步：正向外引物F3與目標序列F2c前端F3c序列互補，以F33’末端為起點，經過鏈置換型DNA聚合酶作用，一邊置換先頭由引物FIP合成DNA鏈，一邊合成本身DNA鏈，如此向前延伸。微生物檢驗專題知識講座第79頁第四步：最終由引物F3合成DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。微生物檢驗專題知識講座第80頁第五步：由引物FIP先合成DNA鏈被引物F3進行鏈置換反應，從而產生一條單鏈，這條單鏈5’末端存在互補F1c和F1區段。微生物檢驗專題知識講座第81頁第六步：5’末端互補F1c和F1區段，會發生本身堿基互補配對，形成環狀結構。同時，反向內引物BIP同該單鏈雜交結合，以引物BIPB2區段3’端為起點，合成互補鏈，在此過程中環狀結構被打開，接著，類似于引物F3，反向外引物B3從引物BIP外側插入，與B3c序列互補。微生物檢驗專題知識講座第82頁第七步：以B33’末端為起點，經過鏈置換型DNA聚合酶作用，一邊置換先頭由引物BIP合成DNA鏈，一邊合成本身DNA鏈，如此向前延伸。最終由引物B3合成DNA鏈形成雙鏈。微生物檢驗專題知識講座第83頁第八步：由引物BIP先合成DNA鏈被引物B3進行鏈置換反應，產生一條單鏈，這條單鏈DNA兩端存在互補序列。本身發生堿基互補配對，形成環狀結構，于是整條鏈展現啞鈴狀結構。該啞鈴狀結構是LAMP法核酸擴增起始結構。至此為止，以上全部步驟都是為了形成LAMP法核酸擴增起始結構。微生物檢驗專題知識講座第84頁第九步：以下是LAMP法核酸擴增循環：微生物檢驗專題知識講座第85頁LAMP法操作流程（1）反應體系配置；（2）擴增；（3）擴增產物檢測。微生物檢驗專題知識講座第86頁微生物檢驗專題知識講座第87頁一個標準LAMP反應反應體系是：20MmTris-HCL(Ph=8.8)1.4mMdNTPs10mMKCL1.6μMFIP8mMMgSO41.6μMBIP10mM(NH4)2SO40.2μMF30.1%吐溫200.2μMB30.8M甜菜堿模板DNA8UBstDNA聚合酶微生物檢驗專題知識講座第88頁LAMP反應過程LAMP反應在操作時候很簡單，只需要將全部反應物混合好以后，先在60-65℃孵育，15-60分鐘后，再在80℃孵育10分鐘終止酶活，即可完成反應。微生物檢驗專題知識講座第89頁擴增產物檢測1.肉眼觀察法能夠經過副產物焦磷酸鎂沉淀產生來經過肉眼直接判斷擴增反應是否發生。2.添加熒光染料法向反應體系中添加溴化乙錠（EB）、SYBRGreenI等熒光染料進行呈色，從而檢測擴增反應是否發生。微生物檢驗專題知識講座第90頁微生物檢驗專題知識講座第91頁第三章基因芯片技術檢測食品微生物一、生物芯片及其分類生物芯片是將大量生物識別分子按預先設置排列固定于一個載體（如硅片、玻片及高聚物載體等）表面，利用生物分子特意性親和反應，如核酸雜交反應，抗原抗體反應等來分子各種生物分子存在量一個技術。微生物檢驗專題知識講座第92頁微生物檢驗專題知識講座第93頁微生物檢驗專題知識講座第94頁1，依據生物化學反應過程分為，及各種等、（1）用于樣品制備生物芯片樣品制備芯片目標是將通常需要在試驗室進行多個操作步驟集成于微芯片上。實現生物大分子分離。（2）生化反應生物芯片生化反應芯片即在芯片上完成生物化學反應。它能夠高效、快速地完成生物化學反應（3）檢測用生物芯片用來檢測生物樣品一、生物芯片及其分類微生物檢驗專題知識講座第95頁2.依據功效和應用角度分為（1）DNA芯片（2）蛋白質芯片（3）芯片試驗室為高度集成化集樣品制備、基因擴增、核酸標識及檢測為一體便攜式生物分析系統，它最終目標是實現生化分析全過程全部集成在一片芯片上完成一、生物芯片及其分類微生物檢驗專題知識講座第96頁3.按基質材料分：尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠4.按檢測生物信號分：核酸、蛋白質、生物組織碎片等5.按工作原理分：雜交型、合成型、連接型、親和識別等一、生物芯片及其分類微生物檢驗專題知識講座第97頁（三）特點（1）

信息獲取量大、效率高；（2）

生產成本低（3）

所需樣本和試劑少（4）輕易實現自動化分析

微生物檢驗專題知識講座第98頁二、歷史沿革1.生物芯片技術發展最初得益于（EdwinMellorSouthern）提出核酸雜交理論，