《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質譜法（征求意見稿）》編制說明《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質譜法》標準編制組二0二三年四月《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質譜法》編制說明1項目背景1.1任務來源根據浙江省食品學會關于2022年度第一批團體標準立項的通知，南開大學、浙江工商大學、杭州海關技術中心組織起草工作組負責團體標準《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質譜法》草案稿的起草工作，并由浙江省食品學會歸口。1.2標準制訂工作主要過程2022年10月：提交《食品中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質譜法》草案稿2022年12月：召開標準起草工作組會議2023年2月：在全國團體標準信息平臺發布該標準征求意見稿2023年4月：根據征求意見對標準進行修改，形成送審稿2023年6月：召開團體標準評審會2023年8月：正式發布該團體標準1.3與我國法律法規和其他標準的關系經查新機構查新，目前國內外沒有相關的多種過敏原同時定性和定量檢測的技術標準。國內標準：目前過敏原檢測有國家標準GB/T38163-2019《常見過敏蛋白的測定液相色譜-質譜串聯法》和出入境檢驗檢疫行業標準SN/T5276-2020《口食品中多種過敏原的測定液相色譜-質譜串聯法》出。這兩種方法都是進行單一過敏原的定性檢測，外標法進行定量，準確度和通量都低。即，不能實現對多種過敏原的同步定性和精準定量。其他參考了《AOACSMPR2016.002StandardMethodPerformanceRequirements(SMPRs?)forDetectionandQuantitationofSelectedFoodAllergens》及《食品檢驗操作技術規范（理化檢驗）》中的技術要求。2標準制訂的必要性（標準制訂工作的目的與意義）2.1食物過敏已成為全球廣泛關注的重大公共衛生和食品安全問題食物過敏是人體攝入食物中的某種成分（過敏原或變應原）后，機體對其產生的異常免疫反應。食物過敏反應發生迅速，微小劑量即可引發消化問題、蕁麻疹或氣道腫脹等體征和癥狀，有的可導致嚴重癥狀，甚至危及生命。近年來食物過敏已成為全球廣泛關注的重大公共衛生和食品安全問題。一些國外流行病學調查研究表明,在世界范圍內食物過敏影響近8%的5歲以下兒童和5%的成年人。我國尚沒有全國性的食物過敏發生率的調查，但區域調查的結果顯示我國的食物過敏形勢也不容樂觀。如2016對全國31個城市兒童食物過敏調查情況顯示，0-14歲兒童食物過敏報告率為5.83%，2022年溫州市、江西省調查顯示兒童過敏報告率分別為12.86%和3.75%等。隨著經濟貿易全球化，食品種類越來越豐富和多樣，食物過敏的發生率也以每年10%的速度遞增[7]，嚴重影響了易敏人群的身體健康，也給其家庭和社會帶來沉重的負擔。2.2過敏原定量檢測的必要性針對食物過敏治療，目前尚無完備方案及特效藥，食物過敏聯盟（FoodAllergyandAnaphylaxisNetwork,FAAN）、美國國家過敏和傳染病研究所（NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,NIAID）等的研究結果均表明，避免接觸或攝入過敏原是防止過敏反應發生的唯一有效途徑。食物過敏原標簽制度是國際公認控制食物過敏的最有效手段，易敏人群通過識別食品標簽規避對自己有害的食物過敏原。目前，歐美日澳加韓等30多個國家或地區相繼對食物過敏原標識進行了規定。我國GB7718-2011《預包裝食品標簽通則》中也規定，食品及其制品若可能導致過敏反應，需要進行標注。食品標簽準確標注過敏原信息依賴于過敏原精準檢測技術，所以建立準確的過敏原檢測方法可以為過敏原標識標準實施提供技術支撐。更重要的是，食物過敏原按“風險管理”的方式在國內外形成廣泛共識，隨著激發過敏反應的過敏原閾值被逐漸確定，在實際檢測中需要關于過敏性食品的閾值劑量的準確數據（不會在食物過敏人群中引起反應的最高水平的過敏原），從而更有效地向消費者傳達這些風險。可見，精準、靈敏的過敏原定量檢測技術可為準確評估食物過敏性風險提供技術基礎。3國內外相關分析方法研究3.1國內外現有食物過敏原檢測技術目前已有多種檢測技術應用于食物中潛在過敏原的檢測，一類是基于蛋白水平的免疫學檢測技術，如免疫吸附實驗(radio-allergosorbenttest,RAST)、酶吸附實驗(enzymeallergosorbenttest,EAST)、火箭免疫電泳(rockedimmuno-electrophoresis,RIE)、免疫印跡(immuno-blotting)、酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)等。免疫學方法是目前應用最廣的過敏原檢測方法之一，但由于靶蛋白構象易受加工過程（熱處理，pH變化，水解等）的影響，檢測結果往往會出現假陽性或假陰性，準確度較差。另一類是基于基因水平的分子生物學檢測技術，包括基聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)，實時熒光定量PCR法(quantitativereal-timePCR)以及環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)等。PCR法是間接檢測食物過敏原，難以反應過敏原蛋白的真實情況，具有一定的局限性。此外，隨著檢測新技術和新裝備的發展，針對食物過敏原已有不少儀器檢測技術，如,生物傳感器，納米材料等。而質譜分析技術以高分辨率、高靈敏度、高通量等優勢，在食物過敏原的識別、表征以及定量等研究領域發揮了巨大的作用，成為近年來的研究熱點，被認為是過敏原精準定量檢測的有力技術手段。3.2同位素稀釋質譜法的優越性同位素稀釋質譜法（Isotopedilutionmassspectrometry，IDMS）被國際計量組織定為基準方法，是唯一能直接提供微量、痕量和超痕量量值的權威方法[11,12]。也被定為國際上食品安全檢測最權威的仲裁檢測方法，可實現復雜食品基質中目標物精準定量的重要確證技術，通過將已知質量和豐度的穩定同位素標記物加入到待測樣品中，可有效校正檢測過程中的基質效應[13]。該技術以篩選到的靶蛋白特征肽段為待檢目標物，對應的同位素標記定量特征肽段為內標。由于目標待測物質與其同位素標記物在樣本前處理，后期的色譜分離、離子化、質譜分析的整個過程在一起，過程中各因素影響程度相同，因此可以將各類誤差降至最低，具有較高的準確度。3.3現有質譜法檢測食物致敏原存在的問題在現代化的飲食模式中，加工類食品已成為主要的食品消費模式。目前針對食物過敏原的IDMS方法多是基于單一未加工過敏食物如花生、大豆、雞蛋、牛奶、榛子等建立的，與實際檢測的復雜加工食品（面包、餅干、豆瓣醬、魚丸蝦丸等）或餐飲食品（沙拉、三明治等）不同。相較于未加工的過敏性食物，加工食品中的過敏原具有復雜性、多樣性和痕量性的特征，對過敏原的精準定量檢測技術提出了更高的要求。首先，加工食品中組分眾多，基質效應更加復雜。且食品加工過程（高溫、美拉德反應、低PH等）會對過敏原的結構等信息產生較大影響，從而影響過敏原的可檢測性[14]。有研究將6種食物過敏原加入巧克力和奶粉基質，質譜掃描分析結果也可以看到：在兩種基質中，檢測到的肽段數量和種類顯著不同。鑒于加工食品中過敏原的復雜性，對篩選的特征肽段提出了更高的要求，用于檢測的過敏原特征肽段需較少受基質效應和加工過程的影響。其次，加工食品中往往含有不止一種的食物過敏原，如堅果面包就同時含有小麥、雞蛋、牛奶、堅果等過敏物質。冰淇淋中同時含有牛奶、雞蛋、堅果等過敏性食物。由于絕大多數的加工食品都同時含有多種過敏原，具有多樣性的特點，因此，高通量的檢測方法極具優勢，可大大提高檢測效率。同時，食品加工環境復雜，鏈條長，在加工制造過程中因共用加工生產線、共用存儲空間等原因而常常存在“痕量”的“cross-contact”。由于極少量的（mg級）食物過敏原即可激發過敏反應[9]，所以加工食品中隱蔽的痕量過敏原極具危險性，潛在風險較大。因此過敏原的檢測方法應具有較高的靈敏度，以便能夠準確的檢測出潛在的痕量過敏原。3.4本標準應用方法的目的和意義建立過敏原精準、靈敏、高通量的檢測方法具有重要的應用價值，是保障過敏原標識標準順利實施、準確評估食品中的過敏原風險、保障我國食品安全和大眾健康的技術手段和必然要求，具有良好的應用前景。從應用場景“復雜加工食品”出發建立食物過敏原的確證檢測技術，建立一種可以同時對食品中多種過敏原定性和定量的檢測方法。其特點一方面可以實現多重檢測，通量高，可同時對食物中多種植源性過敏原（小麥、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻）檢測；特點二是既能定性，同時又能絕對定量，且內標法的準確度遠高于外標法。用該方法進行食物過敏原的檢測既能提質（準確性高），其多重檢測的特點又使得其檢測效率提高，檢測成本下降，達到了降本增效的目的。4標準查一下，是制訂，還是制訂。通篇改一下制訂的基本原則和技術路線查一下，是制訂，還是制訂。通篇改一下4.1標準制訂原則根據《中華人民共和國食品安全法》及其實施條例等有關法律法規，按GB/T1.1-2020的編寫原則進行編寫。以加強海藻纖維衛生安全為原則，深入調查研究，保證起草工作的科學性、規范性和可操作性。（一）可操作性原則本文件制訂過程中根據可操作性的原則，結合實際情況，對文件內容進行科學設定。為生產企業、檢測單位、市場監督等部門提供科學管理的依據。（二）與國內外標準協調一致原則在制訂過程中，起草組按照食品安全標準《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》（GB/T1.1-2020）中的原則要求進行編寫。仔細查閱國內外的相關標準，根據實際情況，確定了團標的框架結構和各項技術內容要求。（三）公開透明的原則起草過程中堅持公開、透明的原則，除召開專家座談會聽取意見外，還將向社會公開廣泛征求意見，如來自行業協會、檢測機構、生產企業以及食品安全監督管理部門等各方意見，并吸收和采納部分意見。4.2標準制訂的技術路線技術路線見下圖。圖SEQ圖\*ARABIC1標準制訂的技術路線示意圖5方法研究報告5.1方法研究的目標本標準規定了加工食品中小麥、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻過敏原定量確證液相色譜-串聯質譜檢測方法。本標準適用于餅干、巧克力、冰淇淋、早餐谷物、奶制品等食品基質中小麥、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻過敏蛋白的液相色譜-串聯質譜測定和確證。5.2規范性引用文件在規范性引用文件中，根據要求和管理引用了相關國家標準等文件。5.3術語和定義、縮略語明確了食物過敏、過敏原、過敏蛋白、多肽、特征肽段等定義規定了下列縮略語適用于本文件。DTT：二硫蘇糖醇（dithiothreitol）IAA：碘代乙酰胺（iodoacetamide）IDMS：同位素稀釋質譜法（theisotopedilutionmassspectrometry）LC-MS：液相色譜-串聯質譜法（liquidchromatography-tandemmassspectrometry）PRM：平行反應檢測（parallelreactionmonitoring）Tris：三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]5.4原理利用質譜技術篩選出過敏原特征肽段。利用同位素標記特征肽段（重標肽段）和目標特征肽段（輕標肽段）具有相同的理化性質的特點，以同位素標記肽段為內標，建立輕標肽段與重標肽段豐度比與過敏原含量的線性關系，內標法定量。5.5主要試劑及試劑配制根據實驗確定食物中多種植源性過敏原同步定量確證同位素稀釋質譜法所需的試劑5.6主要儀器及設備根據實驗確定了主要儀器及設備：液相色譜-串聯質譜儀：UHPLC和配有HESI源的obitrap高分辨率質譜；分析天平：測量精度為0.0001g；恒溫水浴鍋；離心機：轉速不低于12000g；組織研磨器；各規格移液器；pH計：測量精度為0.01；真空離心濃縮儀；注射器和0.22μm的水系濾膜（聚醚砜濾膜）；酶標儀。5.7試樣制備和保存5.7.1標準溶液制備及保存因難以購買到標準物質，實驗中以摩爾濃度處理，肽段濃度與靶蛋白同摩爾濃度，以此定量。實驗用到的特征肽段和重標特征肽段均要求純度大于98%。目標肽段，也稱輕標肽段，為不含同位素標記氨基酸的各肽段。目標肽段用0.1%的甲酸溶液配置成106fmol/μL的儲備液，每管分裝成10μL，在-80℃長期凍存。使用時每次使用一管，不重復使用。內標肽段，也稱重標肽段，為對應的含有同位素標記氨基酸的肽段。重標肽段也使用0.1%的甲酸溶液配置成106fomol/μL儲備液，每管分裝成10μL，在-80℃長期凍存；使用時每次使用一管，不重復使用。5.7.2基質溶液制備及保存超市購買面粉、巧克力、冰淇淋、麥片、餅干、早餐谷物粉等產品，參照其配料表含有的成分，同時提取總蛋白并酶解后（詳細步驟同8.1試樣前處理），進行質譜掃描，采用fullMS-ddMS2掃描模式，確認其含有的蛋白成分。參照AOACSMPR2016.002要求的基質，且不含目標蛋白的基質用于肽段稀釋。基質參照其說明書的保存條件密封保存；提取的蛋白用Bradford方法測定提取液中總蛋白的濃度，提取液置于-20℃冰箱內保存。質譜分析前的酶解產物用肽段定量試劑盒進行定量，并置于-80℃冰箱內保存。在制樣的操作過程中，應防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。5.8分析步驟5.8.1試樣前處理5.8.1.1蛋白提取、還原、烷基化和酶解1）2-3g的食品樣本充分研磨后，稱量3g放入50mL離心管中，加入20mL300mMTris（pH9.2）、2M尿素，20℃震蕩溫浴30min，90℃水浴10min。2）5000g離心10min。3)取1mL上清用1mL溶解buffer（200mM的NH3HCO3，pH8.2）稀釋。選做步驟：取10μL上清跑SDS；用蛋白定量試劑盒蛋白濃度。4）加入40μL的500mM的DTT，75℃溫育30min；80μL500mM的IAA（避光），室溫溫育30min。5）加入100μL的1%的胰酶乙酸溶液，37℃過夜。6）次日，3000g離心30秒，取上清在90℃孵育10min，終止酶解。7）12000g離心30min，取上清（底部多留一些，上清取500μL足夠）。5.8.1.2脫鹽用MonoSpinC18脫鹽柱（GLSciencesInc.）或其他等同產品進行脫鹽，方法參見產品說明書。簡述為：1）調節樣本pH值：樣本用甲酸調節pH約為3-4。2）condition柱子：加入200μL的乙腈，5000g離心1min。加入200μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。3）上樣：將樣本加入柱子上，5000g離心1-2min。4）加入300μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。5）將柱子放入回收管內，加入300μL80%的乙腈（含0.1%甲酸），5000g離心1-2min。離心所得溶液即為脫鹽后的肽段。5.8.1.3真空懸干用真空濃縮儀懸干脫鹽后的肽段。5.8.6.4上樣前處理上樣前用500μL0.1%的色譜純甲酸回溶懸干后的肽段，12000g離心30min或過0.22μm的PES濾膜。質譜掃描前建議用肽段定量試劑盒確定肽段濃度，根據質譜要求適量上樣。5.8.2標準曲線繪制5.8.2.1輕標肽段系列標準溶液制備取輕標肽段的儲存液用不含目標肽段的食物基質制備得到的胰酶酶解物稀釋至2500，1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25fmol/μL的標準濃度。5.8.2.2重標肽段溶液的制備向上述輕標肽段系列標準溶液中加入固定量的重標肽段，最終小麥重標濃度為100fmol/μL，杏仁重標肽段濃度為200fmol/μL，其余重標肽段濃度均為50fmol/μL。5.8.2.3LC-MS檢測取10μL上述配置好的系列標準溶液，進行LC-MS檢測，采用PRM掃描模式。條件參考8.3儀器參考條件部分。5.8.2.4結果計算輕標肽段和重標肽段產物離子的面積，從而得出豐度比與輕標濃度對應關系的標準曲線，并得到最低定量限（S/N=10時的最低濃度）。5.8.3儀器參考條件5.8.3.1液相色譜條件儀器：ThermoScientic?VanquishBinaryFlexUHPLC或相當者。其中ThermoScientic?VanquishBinaryFlexUHPLC型號的UHPLC包含以下組件：SystemBaseVanquishFlex(P/NVF-S01-A)；BinaryPumpF(P/NVF-P10-A-01)；SplitSamplerFT(P/NVF-A10-A)；ColumnCompartmentH(P/NVH-C10-A)；MSConnectionKitVanquish(P/N6720.0405)；VanquishFPumps100μLMixerSet(P/N6044.5100)；VanquishSplitSamplerHTSampleLoop,100μL(P/N6850.1913)分離條件：流動相A:0.1%甲酸/水;流動相B:0.1%甲酸/乙腈色譜柱:Shim-packGISS-HPC18(metalfreecolumn)3.0μm,2.1mm*150mm(P/N:227-30924-03)柱溫：40℃，stillair液相色譜梯度見表1。表1高效液相色譜梯度洗脫程序Time（min）Flowrate（mL/min）%A%B00.29010300.26040310.21090360.21090370.29010420.290105.8.3.2質譜條件質譜儀器：ThermoScienticTMQExactive或相當者。質譜源參數：表2。表2掃描所選的質譜源參數Sheathgasflowrate35Auxgasflowrate10Sweepgasflowrate0Sprayvoltage3.8kVCapillarytemp320℃S-lensRFlevel55.0Auxgasheatertemp350℃掃描模式：PRM。掃描條件：見表3，表4和表5。表3PropertiesofthemethodGlobalsettingUserroleStandUselockmassesOffChrom.peakwidth(FWHM)5sTimeMethodduration42minGeneralruntime0to42minPolaritypositiveDefaultchargestate2Inclusion2MS2Resolution70,000AGCtarget1e6MaximumIT100msIsolationwindow1.6m/zFixedfirstmass-(N)CE/stepped(N)CE27表4PropertiesofPRM表5inclusionlist設置Mass（m/z）CS(z)PolarityStart[min]End[min]479.610003positive11.4513.45481.943003positive11.4513.45525.793002positive13.7115.71528.793002positive13.7115.71560.786002positive8.4810.48563.786002positive8.4810.48571.800002positive11.8613.86574.800002positive11.8613.86576.288002positive5.977.97579.288002positive5.977.97678.847002positive7.299.29682.347002positive7.299.29684.355003positive14.6016.60687.688003positive14.6016.60713.433402positive19.2021.20716.433402positive19.2021.20849.968002positive20.1622.16852.968002positive20.1622.165.8.4測定5.8.4.1定性和定量測定該方法能同時完成定性和絕對定量。按8.1試樣前處理的步驟對樣本進行處理，除了在胰酶酶解步驟后加入和標準曲線繪制時等量的重標肽段。采用和標準曲線繪制時同樣的液相色譜條件和質譜條件進行掃描。用和標準曲線繪制時一樣的參數進行數據處理，得到輕標肽段和重標肽段的豐度比。每例樣本進行三個平行實驗。待測物質的保留時間，與重標肽段的保留時間偏差在±2.5％之內，且樣本中所選肽段定性離子均出現（附錄Ａ中表A.1），則樣本中含有相應的主要過敏原。根據內標法原理，將測得的產物離子峰的豐度比值代入基質相近的標準曲線，得到樣本中含有的過敏原的絕對數量。對于同時有多個特征肽段的過敏原物質，應根據質譜響應選擇最佳肽段用于定量，其余肽段用于輔助過敏原物質定性。5.8.4.2空白實驗除不加試樣外，均按以上操作步驟進行。5.9結果計算和表述試樣中過敏原物質的含量按式（1）進行計算，計算結果保留兩位有效數字。C=C=X×V×Mm×106……………（1）式中：C——試樣中被測組分的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；X——從標準工作曲線得到的被測組分溶液濃度，單位為飛摩爾每微升（fmol/μL）；V——樣品定容體積，單位為毫升（mL）；M——過敏原蛋白的分子量，單位為千克每摩爾（kg/mol）;m——樣品稱樣量，單位克（g）。5.9.1精密度在重復性條件下，獲得的三次獨立測定結果差值的絕對值，不得超過其算術平均值的20％。5.9.2線性和定量限通過實驗確定不同基質中的定量標準曲線、線性范圍及定量限5.9.3回收率通過實驗確定不同基質中添加濃度水平各待測過敏原的回收率范圍6方法驗證6.1方法驗證方案參考了《AOACSMPR2016.002StandardMethodPerformanceRequirements(SMPRs?)forDetectionandQuantitationofSelectedFoodAllergens》及《食品檢驗操作技術規范（理化檢驗）》中的方法驗證要求，在3家有資質的實驗室進行準確度和精密度驗證。具體驗證方案如下：方法準確度：樣品中加入標準品，通過加標實驗計算回收率。6.2方法驗證的主要過程驗證方案設計；建立質量檢驗要求；選定分析人員和單位；樣品的統一制備；數據記錄、處理；最后報告結果。被委托機構按照委托方提供的驗證方法，結合已有的設備儀器情況進行驗證，具體方法見方法研究報告。6.3方法驗證結果經驗證，該方法符合標準要求，回收率在60-120%之間。表6肽段回收率項目加標量理論Arearatio實際Arearatio回收率%（實際Arearatio-截距/理論Arearatio-截距平均回收率fmol/μL榛子TNDNAQISPLAGR2.50.01750.0125571.51%71.51%0.0125571.51%250.20450.2035599.51%98.04%0.1975596.58%2502.08351.9945595.73%96.66%2.0335597.60%榛子ADIYTEQVGR2.50.05340.052498.13%97.19%0.051496.25%250.66240.653498.64%99.09%0.659499.55%2506.64146.565498.86%98.76%6.552498.66%核桃ISTVNSHTLPVLR2.50.04350.041595.40%94.25%0.040593.10%250.46950.437593.18%96.38%0.467599.57%2504.58154.514598.54%96.70%4.346594.87%杏仁GNLDFVQPPR2.50.01630.012375.46%72.39%0.011369.32%250.21230.199393.88%94.58%0.212395.29%2502.11332.081398.49%98.39%2.077398.30%腰果ADIYTPEVGR2.50.08200.060073.16%76.82%0.066080.48%250.70800.666094.07%94.35%0.670094.63%2506.80706.625097.33%98.07%6.726098.81%芝麻AFYLAGGVPR2.50.07980.069887.47%88.10%0.070888.72%250.80580.777896.53%97.52%0.793898.51%2507.47287.459899.83%98.34%7.237896.86%大豆VLIVPQNFVVAAR250.47110.431191.51%92.25%0.438193.00%2505.01114.915198.08%98.09%4.916198.10%花生RPFYSNAPQEIFIQQGR2.50.13420.110282.12%86.22%0.121290.31%250.42020.417299.29%97.62%0.403295.95%2502.64122.482293.98%99.37%2.6002104.75%小麥2506.9475.48179.0%78.92%YFIALPVPSQPVDPR5.48878.9%牛奶TPEVDDEALEK250.20420.192295.05%97.04%0.202299.02%2502.83822.629292.64%97.29%2.6802101.94%牛奶HQGLPQEVLNENLLR2.50.00870.006777.02%88.51%0.0087100.00%250.13070.111785.46%91.97%0.128798.47%2501.70271.686799.06%97.68%1.639796.30%雞蛋GGLEPINFQTAADQAR2.50.08370.080796.42%96.42%250.33370.276782.92%85.02%0.290787.12%2504.06173.848794.76%95.65%3.921796.55%蝦蟹AISNAEGEVAALNR250.27160.244690.06%100.34%0.2706110.63%2503.35163.317698.99%97.96%3.248696.93%魚TIDDLEDELYAQK250.03530.030385.83%85.83%2500.66730.606390.86%89.88%0.593388.91%7標準實施建議本方法的過敏原特征肽段作為“內標試劑”，形成的高通量定量確證方法可以推廣應用于國家及省市食品安全風險評估中心或監測中心對食品過敏原的國檢、法檢中。還可應用于企業對產品的過敏原篩查及污染源追溯之中。此外，隨著國際上30多個國家或地區出臺了過敏原標簽標識的規定，本研究形成和建立的食品中多過敏原的高通量定量檢測技術，還可應用于食品加工企業的委托檢驗，以便準確進行標簽標識，避免因過敏原標識錯誤而導致的產品撤回和召回，保證進出口食品貿易順利進行。8參考文獻[1]LopesJP,SichererS.Foodallergy:epidemiology,pathogenesis,diagnosis,prevention,andtreatment.CurrOpinImmunol.2020Oct;66:57-64.

[2]arrenCM,JiangJ,GuptaRS.EpidemiologyandBurdenofFoodAllergy.CurrAllergyAsthmaRep.2020Feb14;20(2):6.doi:10.1007/s11882-020-0898-7.[3]SichererSH,SampsonHA.Foodallergy:A

reviewandupdateonepidemiology,pathogenesis,diagnosis,prevention,andmanagement.JAllergyClinImmunol.2018Jan;141(1):41-58.[4]解洪麗,邵明軍,劉傳合,等.全國31城市兒童食物過敏患病情況調查[C].第八次全國中西醫結合變態反應學術會議暨首屆深圳市中西醫結合變態反應學術會議暨第十屆深圳呼吸論壇.0.[5]DaiH,WangF,WangL,WanJ,XiangQ,ZhangH,ZhaoW,ZhangW.Anepidemiologicalinvestigationoffoodallergyamongchildrenaged3to6inanurbanareaofWenzhou,China.BMCPediatr.2020May14;20(1):220.[6]胡次浪,黃堅,丁國標,等.江西省3~14歲兒童慢性咳嗽流行病學特征[J].中國婦幼保健,2022,37(24):4.[7]Riskassessmentoffoodallergens:part1:reviewandvalidationofCodexalimentariuspriorityallergenlistthroughriskassessment:meetingreport.2022March29.[8]AllenKJ,RemingtonBC,BaumertJL,CrevelRW,HoubenGF,Brooke-TaylorS,KruizingaAG,TaylorSL.Allergenreferencedosesforprecautionarylabeling(VITAL2.0):clinicalimplications.JAllergyClinImmunol.2014Jan;133(1):156-64.[9]RemingtonBC,WesterhoutJ,MeimaMY,BlomWM,KruizingaAG,WheelerMW,TaylorSL,HoubenGF,BaumertJL.Updatedpopulationminimalelicitingdosedistributionsforuseinriskassessmentof14priorityfoodallergens.FoodChemToxicol.2020May;139:111259.[10]CavazzaA,MattarozziM,FranzoniA,CareriM.Aspotlightonanalyticalprospectsinfoodallergens:Fromemergingallergensandnovelfoodstobioplasticsandplant-basedsustainablefoodcontactmaterials.FoodChem.2022Sep15;388:132951.

[11]LinscheidMW.Moleculesandelementsforquantitativebioanalysis:Theallureofusingelectrospray,MALDI,andICPmassspectrometryside-by-side.MassSpectromRev.2019Mar;38(2):169-186.[12]ALONSOJIG,GONZALEZPR.IsotopeDilutionMassSpectrometry[M].RoyalSocietyofChemistry,2013.[13]López-PedrousoM,LorenzoJM,GagaouaM,FrancoD.CurrentTrendsinProteomicAdvancesforFoodAllergenAnalysis.Biology(Basel).2020Aug25;9(9):247.

[14]KorteR,OberleitnerD,BrockmeyerJ.DeterminationoffoodallergensbyLC-MS:Impactsofsamplepreparation,foodmatrix,andthermalprocessingonpeptidedetectabilityandquantification.[15]PilolliR,VanPouckeC,DeAngelisE,NitrideC,deLooseM,GillardN,HuetAC,TranquetO,LarréC,Adel-PatientK,BernardH,MillsENC,MonaciL.DiscoverybasedhighresolutionMS/MSanalysisforselectionofallergenmarkersinchocolateandbrothpowdermatrices.FoodChem.2021May1;343:128533.

[16]SkypalaIJ.Food-InducedAnaphylaxis:RoleofHiddenAllergensandCofactors.FrontImmunol.2019Apr3;10:673.[17]VincentPaez,WBradleyBarrett,XiaojunDeng,CarmenDiaz-Amigo,KatherineFiedler,ChristopheFuerer,GregoryLHostetler,PhilJohnson,GeorgeJoseph,ErikJMKonings,MarkusLacorn,JohnLawry,HuafenLiu,EricMarceau,KaterinaMastovska,LisaMonteroso,Shang-JingPan,ChristineParker,MelissaMeaneyPhillips,BertPopping,ScottRadcliffe,CatherineARimmer,MartinRoder,AndreSchreiber,JenniferSealey-Voyksner,JeffreyShippar,DarsaPSiantar,DarrylMSullivan,JulieSundgaard,JohnSzpylka,JeffTurner,BryanWirthwine,JasonLynnWubben,SudhakarYadlapalli,JinchuanYang,JupiterMYeung,JerryZweigenbaum,ScottGCoates,AOACSMPR?2016.002,JournalofAOACINTERNATIONAL,Volume99,Issue4,1July2016,Pages1122–1124,[18]中國食品藥品檢定研究院.食品檢驗操作技術規范（理化檢驗）一中國食品藥品檢定研究院2019.8出版.中國醫藥科技出版社,2019.8.[19]國家標準化管理委員會.《常見過敏蛋白的測定液相色譜-串聯質譜法》（GB/T38163-2019）.[20]中華人民共和國海關總署，《口食品中多種過敏原的測定液相色譜-質譜串聯法》.SN/T5276-2020附件一方法驗證報告方法名稱：食品中多種過敏原同步定量確證檢測方法同位素稀釋質譜法委托單位：南開大學驗證單位：中國檢驗檢疫科學研究院驗證日期：2023.02.27-2023.03.08一、驗證依據本方法驗證依據為：實驗室對所提供的方法已進行確認，證實該方法能同時對食物中多種過敏原（雞蛋、牛奶、小麥、大豆、花生、魚、甲殼類、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻）進行定性和絕對定量，委托本公司進行驗證。方法原理同位素稀釋質譜法（Isotopedilutionmassspectrometry，IDMS）已被定為國際上食品安全檢測最權威的仲裁檢測方法，精確度和精度高。IDMS方法利用穩定同位素標記的待測物質與未標記的待測物質之間具有相同的理化性質，采用離子監測模式或多反應監測模式，通過不同的離子通道捕獲各自的豐度值，進而進行準確定量。由于目標待測物質與其同位素標記物在樣本前處理，到后期的色譜分離、離子化、質譜分析的整個過程在一起，過程中各因素影響程度相同，因此可以將各類誤差降至最低，具有較高的準確度。驗證內容樣品中加入標準品，通過加標實驗計算回收率。驗證方法按照委托方提供的驗證方法，結合已有的設備儀器情況進行驗證，具體方法見附件。驗證結果項目加標量理論Arearatio實際Arearatio回收率%（實際Arearatio-截距/理論Arearatio-截距平均回收率fmol/μL榛子TNDNAQISPLAGR2.50.01750.0125571.51%71.51%0.0125571.51%250.20450.2035599.51%98.04%0.1975596.58%2502.08351.9945595.73%96.66%2.0335597.60%榛子ADIYTEQVGR2.50.05340.052498.13%97.19%0.051496.25%250.66240.653498.64%99.09%0.659499.55%2506.64146.565498.86%98.76%6.552498.66%核桃ISTVNSHTLPVLR2.50.04350.041595.40%94.25%0.040593.10%250.46950.437593.18%96.38%0.467599.57%2504.58154.514598.54%96.70%4.346594.87%杏仁GNLDFVQPPR2.50.01630.012375.46%72.39%0.011369.32%250.21230.199393.88%94.58%0.212395.29%2502.11332.081398.49%98.39%2.077398.30%腰果ADIYTPEVGR2.50.08200.060073.16%76.82%0.066080.48%250.70800.666094.07%94.35%0.670094.63%2506.80706.625097.33%98.07%6.726098.81%芝麻AFYLAGGVPR2.50.07980.069887.47%88.10%0.070888.72%250.80580.777896.53%97.52%0.793898.51%2507.47287.459899.83%98.34%7.237896.86%大豆VLIVPQNFVVAAR250.47110.431191.51%92.25%0.438193.00%2505.01114.915198.08%98.09%4.916198.10%花生RPFYSNAPQEIFIQQGR2.50.13420.110282.12%86.22%0.121290.31%250.42020.417299.29%97.62%0.403295.95%2502.64122.482293.98%99.37%2.6002104.75%小麥2506.9475.48179.0%78.92%YFIALPVPSQPVDPR5.48878.9%牛奶TPEVDDEALEK250.20420.192295.05%97.04%0.202299.02%2502.83822.629292.64%97.29%2.6802101.94%牛奶HQGLPQEVLNENLLR2.50.00870.006777.02%88.51%0.0087100.00%250.13070.111785.46%91.97%0.128798.47%2501.70271.686799.06%97.68%1.639796.30%雞蛋GGLEPINFQTAADQAR2.50.08370.080796.42%96.42%250.33370.276782.92%85.02%0.290787.12%2504.06173.848794.76%95.65%3.921796.55%蝦蟹AISNAEGEVAALNR250.27160.244690.06%100.34%0.2706110.63%2503.35163.317698.99%97.96%3.248696.93%魚TIDDLEDELYAQK250.03530.030385.83%85.83%2500.66730.606390.86%89.88%0.593388.91%驗證結論該方法符合標準要求，回收率在60-120%之間。附件：委托方提供的驗證方法。食品中多種過敏原同步定量確證檢測方法同位素稀釋質譜法主要試劑及試劑配制除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682規定的一級水。碳酸氫銨（NH4HCO3）。二硫蘇糖醇（C4H10O2S2，DTT）。碘代乙酰胺（ICH2CONH2，IAA）。三羥甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）尿素（CH4N2O）。鹽酸。考馬斯亮藍染色液。胰酶（Trypsin）：質譜級。蛋白分子量標準（10-170K）。0.1%的甲酸（CH3COOH）：色譜純。含0.1%甲酸的乙腈（CH3CN）：色譜純。Tris-HCl（pH9.2）：購買pH9.5的Tris-HCl，加濃鹽酸調pH值到9.2±1.0。500mMNH4HCO3：稱取3.95g碳酸氫銨，用水溶解后定容至100mL。500mM的DTT（二硫蘇糖醇）：稱取0.771g的二硫蘇糖醇，用500mM的碳酸氫銨溶液溶解后定容至10mL。4℃冰箱冷藏可保存一個月。500mM的IAA（碘代乙酰胺）：稱取0.925g的碘代乙酰胺，用500mM的碳酸氫銨溶液溶解后定容至10mL。4℃冰箱避光冷藏可保存一個月。8M尿素：稱取48g的尿素，用500mM的碳酸氫銨溶液溶解后定容至100mL。4℃冰箱冷藏。胰蛋白酶：20μg的胰酶，加入1mL的1%乙酸溶液，即為2%的胰酶溶液。主要儀器及設備液相色譜-串聯質譜儀：ThermoScienticUltiMate?3000UHPLC系統和配有HESI源的ThermoScienticTMQExactive高分辨率質譜。分析天平：測量精度為0.0001g。恒溫水浴鍋。離心機：轉速不低于12000g。組織研磨器。各規格移液器。pH計：測量精度為0.01。真空離心濃縮儀。注射器和0.22μm的水系濾膜（聚醚砜濾膜）。酶標儀。標準品溶液制備及保存因難以購買到標準物質，實驗中以摩爾濃度處理，肽段濃度與靶蛋白同摩爾濃度，以此定量。實驗用到的特征肽段和重標特征肽段（表1）純度均大于98%。目標肽段，也稱輕標肽段，為不含同位素標記氨基酸的各肽段。目標肽段用0.1%的甲酸溶液配置成106fmol/μL的儲備液，每管分裝成10μL，在-80℃長期凍存。使用時每次使用一管，不重復使用。內標肽段，也稱重標肽段，為對應的含有同位素標記氨基酸的肽段。重標肽段也使用0.1%的甲酸溶液配置成106fomol/μL儲備液，每管分裝成10μL，在-80℃長期凍存；使用時每次使用一管，不重復使用。基質溶液制備及保存超市購買面粉、巧克力、冰淇淋、麥片、餅干、早餐谷物粉等產品，參照其配料表含有的成分，同時提取總蛋白并酶解后（詳細步驟同5.1試樣前處理），進行質譜掃描，采用fullMS-ddMS2掃描模式，確認其含有的蛋白成分。參照AOACSMPR2016.002要求的基質，且不含目標蛋白的基質用于肽段稀釋。基質參照其說明書的保存條件密封保存；提取的蛋白用Bradford方法測定提取液中總蛋白的濃度，提取液置于-20℃冰箱內保存。質譜分析前的酶解產物用肽段定量試劑盒進行定量，并置于-80℃冰箱內保存。在制樣的操作過程中，應防止樣品受到污染或發生殘留物含量的變化。分析步驟試樣前處理蛋白提取、還原、烷基化和酶解（1）2-3g的食品樣本充分研磨后，稱量3g放入50mL離心管中，加入20mL300mMTris（pH9.2）、2M尿素，20℃震蕩溫浴30min，90℃水浴10min。（2）5000g離心10min。取1mL上清用1mL溶解buffer（200mM的NH3HCO3，pH8.2）稀釋。選做步驟：取10μL上清跑SDS；用蛋白定量試劑盒蛋白濃度。（4）加入40μL的500mM的DTT，75℃溫育30min；80μL500mM的IAA（避光），室溫溫育30min。（5）加入100μL的1%的胰酶乙酸溶液，37℃過夜。（6）次日，3000g離心30秒，取上清在90℃孵育10min，終止酶解。（7）12000g離心30min，取上清（底部多留一些，上清取500μL足夠）。脫鹽用MonoSpinC18脫鹽柱（GLSciencesInc.）或其他等同產品進行脫鹽，方法參見產品說明書。簡述為：（1）調節樣本pH值：樣本用甲酸調節pH約為3-4。（2）condition柱子：加入200μL的乙腈，5000g離心1min。加入200μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。（3）上樣：將樣本加入柱子上，5000g離心1-2min。（4）加入300μL0.1%的甲酸，5000g離心1min。（5）將柱子放入回收管內，加入300μL80%的乙腈（含0.1%甲酸），5000g離心1-2min。離心所得溶液即為脫鹽后的肽段。真空懸干用真空濃縮儀懸干脫鹽后的肽段。上樣前用500μL0.1%的色譜純甲酸回溶懸干后的肽段，12000g離心30min或過0.22μm的PES濾膜。質譜掃描前建議用肽段定量試劑盒確定肽段濃度，根據質譜要求適量上樣。標準曲線繪制輕標肽段系列標準溶液制備：取輕標肽段的儲存液用不含目標肽段的食物基質制備得到的胰酶酶解物稀釋至2500，1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25fmol/μL的標準濃度。重標肽段溶液的制備：向上述輕標肽段系列標準溶液中加入固定量的重標肽段，最終小麥重標濃度為100fmol/μL，杏仁重標肽段濃度為200fmol/μL，其余重標肽段濃度均為50fmol/μL。取10μL上述配置好的系列標準溶液，進行LC-MS檢測，采用PRM掃描模式。條件參考8.3儀器參考條件部分。計算輕標肽段和重標肽段產物離子的面積，從而得出豐度比與輕標濃度對應關系的標準曲線，并得到最低定量限（S/N=10時的最低濃度）。儀器參考條件液相色譜條件儀器：ThermoScienticUltimateTM3000UHPLC。其中ThermoScienticUltimateTM3000UHPLC型號的UHPLC包含以下組件:SRD-3600(P/N5035.9230)；HPG-3400RS(P/N5040.0046);WPS-3000TRS(P/N5340.0020);TCC-3000RS(P/N5730.0000);分離條件：流動相A:0.1%甲酸/水;流動相B:0.1%甲酸/乙腈色譜柱:Shim-packGISS-HPC18(metalfreecolumn)3.0μm,2.1mm*150mm(P/N:227-30924-03)柱溫：40℃，stillair液相色譜梯度見表2。表2，高效液相色譜梯度洗脫程序Time（min）Flowrate（mL/min）%A%B00.29010300.26040310.21090360.21090370.29010420.29010質譜條件質譜儀器：ThermoScienticTMQExactive或相當者。質譜源參數：表3。表3，掃描所選的質譜源參數Sheathgasflowrate35Auxgasflowrate10Sweepgasflowrate0Sprayvoltage3.8kVCapillarytemp320℃S-lensRFlevel55.0Auxgasheatertemp350℃掃描模式：PRM。掃描條件：見表4-1，表4-2和表4-3。表4-1，PropertiesofthemethodGlobalsettingUserroleStandUselockmassesOffChrom.peakwidth(FWHM)5sTimeMethodduration42min表4-2，PropertiesofPRMGeneralruntime0to42minPolaritypositiveDefaultchargestate2Inclusion2MS2Resolution70,000AGCtarget1e6MaximumIT100msIsolationwindow1.6m/zFixedfirstmass-(N)CE/stepped(N)CE27表4-3，inclusionlist設置Mass（m/z）CS(z)PolarityStart[min]End[min]479.610003positive10.8012.80481.943003positive10.8012.80525.793002positive13.1515.15528.793002positive13.1515.15560.786002positive8.0610.06563.786002positive8.0610.06571.800002positive11.2813.28574.800002positive11.2813.28576.288002positive5.907.90579.288002positive5.907.90678.847002positive7.079.07682.347002positive7.079.07684.355003positive13.9315.93687.688003positive13.9315.93713.433402positive18.6020.60716.433402positive18.6020.60849.968002positive19.6321.63852.968002positive19.6321.63587.322003positive14.8316.83589.322003positive14.8316.83623.297002positive5.817.81626.790002positive5.817.81844.420002positive13.6915.69849.420002positive13.6915.69518.250003positive13.8415.84520.916003positive13.8415.84707.868002positive8.9010.90711.368002positive8.9010.90測定定性和定量測定該方法能同時完成定性和絕對定量。按5