蛋白質與酶工程第六章酶的固定修飾與改造演示文稿目前一頁\總數一百頁\編于十八點優選蛋白質與酶工程第六章酶的固定修飾與改造目前二頁\總數一百頁\編于十八點第一節固定化酶與固定化細胞一、酶的固定化二、細胞的固定化三、輔酶的固定化目前三頁\總數一百頁\編于十八點一、酶的固定化（一）概念及其優缺點

固定化酶(immobilizedenzyme):

是指將水溶性酶經過化學或物理手段處理，固定在載體上，在一定的空間范圍內起催化作用，并能反復和連續使用的（不溶于水）酶。水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術目前四頁\總數一百頁\編于十八點酶固定化的基本要求①盡可能的保持酶的活性和專一性；②固定化載體應該與酶結合較為牢固，不與底物、產物發生反應，達到多次回收和反復使用；③酶固定化后產生的位阻應該較小，不妨礙酶與底物接近；④成本盡可能低。目前五頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶的優缺點優點：（1）可多次使用；（2）可以裝塔連續化生產（反應）；（3）不溶于水，易于與產物分離，純化簡單；（4）穩定性好，提高產物質量；（5）提供了研究酶動力學的良好模型。（6）應用范圍廣。缺點：（1）首次投入成本高；（2）大分子底物較困難；（3）固定化過程中往往會引起酶的失活。目前六頁\總數一百頁\編于十八點（二）酶固定化的方法固定化方法吸附法共價結合（偶聯）法交聯法包埋法網格型微囊型離子交換吸附物理吸附法無載體固定法多方法聯用目前七頁\總數一百頁\編于十八點目前八頁\總數一百頁\編于十八點目前九頁\總數一百頁\編于十八點目前十頁\總數一百頁\編于十八點目前十一頁\總數一百頁\編于十八點各類固定化方法的特點比較比較項目吸附法共價結合法交聯法包埋法物理吸附共價鍵結合離子鍵結合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強中等強強活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性酶源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶目前十二頁\總數一百頁\編于十八點1.吸附法根據吸附劑的特點分:物理吸附法和離子交換吸附法（1）物理吸附法（physicaladsortion）：通過酶與載體之間的范德華力、氫鍵、疏水作用力等將酶與載體聯系起來的方法。目前十三頁\總數一百頁\編于十八點吸附法★作用力：范德華力、氫鍵、疏水作用力★選擇載體的原則：有機載體和無機載體。①要有巨大的比表面積；②要有活潑的表面；③便于裝柱進行連續反應。★常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、骨膠原、火棉膠、淀粉等。目前十四頁\總數一百頁\編于十八點吸附法的類型根據吸附劑的特點分:物理吸附法和離子交換吸附法（2）離子交換吸附(結合)法（ionbinding）：

通過離子效應，將酶分子固定到含有離子交換基團的固相載體上的固定化方法。?

作用力：離子鍵?

常用載體：DEAE-Cellulose

（二乙氨乙基-纖維素）；DEAE-dextrangel（二乙氨乙基-葡聚糖凝膠）；CM-cellulose（羧甲基纖維素；carboxymethylcellulose）。目前十五頁\總數一百頁\編于十八點吸附法的優缺點優點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結合力弱，易解吸附。目前十六頁\總數一百頁\編于十八點2.包埋法定義：將酶或含酶菌體用物理的方法包埋在各種具有特定網狀結構（多孔）載體（高聚物）中，使酶固定化的方法稱為包埋法。目前十七頁\總數一百頁\編于十八點包埋法的類型分為：凝膠包埋法和微膠囊包埋法（1）凝膠包埋法（網格型包埋法）：將酶包埋在交聯的水不溶的高分子凝膠細微網格中。常用的凝膠可分為天然凝膠和人工凝膠。如海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯樹脂等合成凝膠。目前十八頁\總數一百頁\編于十八點凝膠包埋法的種類

①聚丙烯酰胺凝膠包埋法：將酶包埋在聚丙烯酰胺凝膠中。

②海藻酸鈣包埋法：凝膠包埋法常用的載體有利用海藻提取物海藻酸鈉制成凝膠。③瓊脂糖凝膠包埋法：利用熔化的瓊脂在溫度低于50℃凝固的特性來包埋酶。目前十九頁\總數一百頁\編于十八點使用的多孔載體及其特點凝膠包埋條件酶活性強度天然凝膠瓊脂;海藻酸鈣;角叉菜膠;明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯樹脂聚合反應部分失活高目前二十頁\總數一百頁\編于十八點（2）微膠囊包埋法（半透膜包埋法）微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內的方法。

半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。半透膜孔徑小于酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產物可以自由進出，被稱為“人工細胞”。它使酶存在于類似細胞內的環境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環境直接接觸，從而增加了酶的穩定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。目前二十一頁\總數一百頁\編于十八點（3）纖維素包埋法常用于大規模生產。通過多孔噴絲頭形成中空纖維，將酶包埋在纖維內。目前二十二頁\總數一百頁\編于十八點包埋法的優缺點★優點：

在于它是一種反應條件溫和、很少改變酶結構但是又較牢固的固定化方法。★缺點：

只有小分子底物和產物可以通過高聚物網架擴散，對那些底物和產物是大分子的酶并不適合。這是由于高聚物網架會對大分子物質產生擴散阻力導致固定化酶動力學行為改變，使活力降低。目前二十三頁\總數一百頁\編于十八點3.共價結合（偶聯法）

（Covalentbindingorcovalentcoupling）

共價結合（偶聯）法是目前研究中最為活躍的方法。（1）原理：酶蛋白分子上的功能基團與載體（固相支持物）表面上的反應基團之間以共價鍵的作用而實現結合的固定化方法。（借助共價鍵將酶的非活性必需側鏈基團和載體的功能基團進行偶連）。（2）載體選擇的要求：

①盡量選擇親水性強的載體；②載體結構疏松，表面積大，有一定的機械強度；③載體必須有在溫和條件下與酶共價結合的功能基團；④載體沒有或很少有非專一性吸附；⑤載體容易獲得，能反復使用。目前二十四頁\總數一百頁\編于十八點共價結合（偶聯法）（3）酶蛋白可以形成共價鍵的基團：

游離氨基、游離羧基、巰基、咪唑基、酚基、羥基、甲硫基、吲哚基、二硫鍵。

①酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。②酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。

③半胱氨酸殘基的巰基。④絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。

⑤組氨酸殘基的咪唑基。⑥色氨酸殘基的吲哚基。⑦苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環。目前二十五頁\總數一百頁\編于十八點共價結合（偶聯法）（4）常用的載體：

天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體。親水載體優于疏水載體。※

天然高分子衍生物:

纖維素、瓊脂糖、葡聚糖凝膠；親和性好，機械性能差。※合成聚合物：

聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、尼龍；機械性能好，但有疏水結構。目前二十六頁\總數一百頁\編于十八點共價結合（偶聯法）（5）載體活化（偶聯）的方法：①溴化氰法：即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯，制成固定化酶。②疊氮法：即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應基團偶聯成固定化酶。③烷基化反應法：以鹵素為功能團的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發生烷基化或芳基化反應而使酶固定化。④重氮法：重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方法，是共價鍵法中使用最多的一種。⑤硅烷化法：可在二氧化硅表面引入氨基，活化的表面可以利用一些中間分子（如二氯硫化碳）進一步和酶分子發生連接反應。目前二十七頁\總數一百頁\編于十八點4.交聯法

交聯法（cross-linking）是利用雙功能或多功能試劑在酶分子之間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進行交聯反應，形成網狀結構的酶固定化方法。由于酶蛋白的功能團，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應，所以酶的活性中心構造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯劑濃度和縮短反應時間將有利于固定化酶活力的提高。此法與共價結合（偶聯）法利用的均是共價鍵，不同之處是什么？交聯法不使用載體！目前二十八頁\總數一百頁\編于十八點交聯法常用試劑戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、N,N’-乙烯馬來亞胺、雙重氮聯苯胺和N,N’-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等。

其中應用最廣泛的是戊二醛，它的兩個醛基都可以與酶或蛋白質的游離氨基形成席夫堿(shiffbase)，從而使酶分子之間相互交聯形成固定化酶。目前二十九頁\總數一百頁\編于十八點共價交聯法的四種形式（1）酶直接交聯法：（2）酶輔助蛋白交聯：當可得到的酶量有限，可以使用第二個“載體”蛋白來增加蛋白質濃度，從而使酶與惰性蛋白共交聯的方法。目前三十頁\總數一百頁\編于十八點共價交聯法的四種形式（3）吸附交聯法：此法先將酶吸附在硅膠、藻土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯，用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。（4）載體交聯法：

用多功能試劑的一部分功能基團化學修飾高聚物載體，而其中的另一部分功能基團偶聯酶蛋白。目前三十一頁\總數一百頁\編于十八點四種固定化酶制備方法的特點小結指標物理吸附包埋法共價結合法共價交聯法物理吸附法離子吸附法制備易易較難難較難結合程度弱中等強強強酶活力回收高，易流失高高中中底物專一性無變化無變化無變化有變化有變化再生可能可能不可能不可能不可能固定化費用低低中高中目前三十二頁\總數一百頁\編于十八點（三）固定化酶的評價(一)固定化酶(細胞)的活力測定固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。(二)蛋白總量測定

1.雙辛可寧酸法(Bicinchoninicacid;BCA法)2.考馬斯亮藍法:(三)偶聯率及比（相對）活力測定目前三十三頁\總數一百頁\編于十八點（三）固定化酶的評價(四)固定化酶的操作半衰期

在連續測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間，以t1/2表示。是衡量穩定性的一項重要指標。(五)相對酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶活力與游離酶活力的比值。目前三十四頁\總數一百頁\編于十八點（四）固定化酶的性質和影響因素1.固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。

其中顆粒占絕大多數，它和線條主要用于工業發酵生產，如裝成酶柱用于連續生產，或在反應器中進行批式攪拌反應；

薄膜主要用于酶電極，應用于分析化學；酶管機械強度較大，適用于工業生產。目前三十五頁\總數一百頁\編于十八點（四）固定化酶的性質和影響因素2.固定化對反應體系造成的效應酶經過固定化后引起的性質改變，不外乎兩種原因：一是酶本身的變化，二是受固定化載體的物理或化學性質的影響。（1）構象效應：酶分子在固定化過程中，酶分子與載體相互作用使得酶的活性中心或變構中心構象發生變化。（2）屏蔽效應：酶經固定化后，載體會成為底物或者其他效應物結合到活性中心或者變構中心的空間障礙，可以通過加入連接臂的方式進行改善。目前三十六頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶的性質和影響因素（3）微擾效應：酶固定化后，載體固有的性質會引起緊鄰固定化酶的微環境的變化，使酶的催化能力及酶對效應物作出調節反應的能力發生改變。（4）分配效應：由于載體的親水或者疏水特性以及帶電特征使底物、產物或其他效應物在每所處的微環境和宏觀體系間發生不等分配，改變了酶反應體系的組成平衡。（5）擴散限制效應：指底物、產物和其他效應物在酶的微環境區與宏觀體系之間遷移和運轉速度受到限制的一種效應。目前三十七頁\總數一百頁\編于十八點3.固定化酶（細胞）性質的改變

（1）固定化酶的活力在大多數情況下比天然酶下降，其專一性也會受到影響發生改變。活力下降的原因：

①酶分子在固定化過程中，由于構象效應或調節中心空間構象發生變化或者屏蔽效應造成酶的空間構像發生了變化，活性中心無法與底物結合；②部分活性中心的氨基酸殘基參與了與載體的結合，導致部分酶完全喪失了活性；③固定化后的空間障礙效應的影響；④內擴散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻；⑤包埋法時被高分子物質半透膜包圍。目前三十八頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶（細胞）性質的改變（2）固定化后酶穩定性提高穩定性提高的原因：

①固定化后的酶與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形；②酶活力的緩慢釋放；③反應開始只有部分酶起作用，其余部分僅在開始起作用的酶變性后才起作用；④抑制自降解，提高了酶穩定性。目前三十九頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶（細胞）性質的改變（3）固定化酶（細胞）的最適pH變化

酶固定化后，對底物的最適pH曲線常常發生偏移。

變化規律：

一般來說，帶負電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值較游離酶偏高；反之，若使用帶正電荷載體的話，其最適pH值較游離酶偏低，即向酸性偏移。原因：一是酶本身電荷在固定化前后發生變化；二是由于載體電荷性質的影響致使固定化酶分子內外擴散層的氫離子濃度產生差異；三是由于酶催化反應產物導致固定化酶分子內部形成帶電荷微環境。一般來說，產物為酸性時固定化酶的最適pH比游離酶高一些；產物為堿性時，固定化酶的最適pH比游離酶低一些，產物為中性時，最適pH一般不改變。目前四十頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶（細胞）性質的改變（4）固定化酶（細胞）的最適溫度的變化

固定化酶的最適反應溫度多數較游離酶高，如色氨酸酶經共價結合后最適溫度比固定前提高5～15℃，但也有不變甚至降低的。固定化酶的作用最適溫度會受固定化方法以及固定化載體的影響。

酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反應速度的綜合結果。因為固定化后，酶的熱穩定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是很有利的結果。目前四十一頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶（細胞）性質的改變（5）酶固定后動力學參數(米氏常數；Km)的變化

米氏常數Km反映了酶與底物的親和力。酶經固定化后，酶蛋白分子的高級結構的變化以及載體電荷的影響可導致底物和酶的親合力的變化。固定化酶的表觀米氏常數Km隨載體的帶電性能變化。

簡單說，由于高級結構變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。而這種Km變化又受到溶液中底物離子強度影響：離子強度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。目前四十二頁\總數一百頁\編于十八點固定化酶（細胞）性質的改變（6）固定化酶底物特異性發生變化

固定化酶的底物特異性與底物分子量的大小有一定關系。

一般來說，當酶的底物為小分子化合物時，固定化酶的底物特異性大多數情況下不發生變化。例如，氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構酶等，固定化前后的底物特異性沒有變化；而當酶的底物為大分子化合物時，如蛋白酶、α-淀粉酶、磷酸二酯酶等，固定化酶的底物特異性往往會發生變化。這是由于載體引起的空間位阻作用，使大分子底物難以與酶分子接近而無法進行催化反應，酶的催化活力難以發揮出來，催化活性大大下降。目前四十三頁\總數一百頁\編于十八點二、細胞的固定化1.概念：固定化細胞（immobilizedcell）：固定在載體上并在一定空間范圍內進行生命活動（生長、繁殖、新陳代謝）的細胞。目前四十四頁\總數一百頁\編于十八點二、細胞的固定化2.固定化細胞（原生質體）的意義：

(1)使用固定化細胞省去了酶的分離手續，可顯著降低成本。(2)固定化細胞為多酶系統，無須輔因子再生。

(3)細胞固定化后對不利環境的耐受性增加，細胞可重復利用，簡化了細胞培養過程。(4)保持酶在細胞內的原始狀況，增加了酶的穩定、特別是對污染因子的抵抗力增加。

(5)細胞生長快而且多，可以連續發酵，節約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊排出發酵液，一邊進行培養，排除了產物抑制和消耗。

(6)固定化細胞（原生質體）去除了細胞壁的擴散障礙，有利于氧的傳遞，營養成分的吸收和胞內產物的分泌。目前四十五頁\總數一百頁\編于十八點固定化細胞同時也存在—些缺點

(1)必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產品純度。

(2)必須防止細胞內蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內其他酶的活性防止副產物的形成。

(3)細胞膜、細胞壁會阻礙底物滲透和擴散。目前四十六頁\總數一百頁\編于十八點（一）植物細胞固定化植物細胞比菌體細胞嬌嫩得多，需要溫和的固定化方法。1.吸附法：吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內，或吸附于中空纖維外壁上。2.包埋法：

包埋法是將植物細胞包埋于瓊脂、海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、明膠和角叉菜膠等多孔凝膠中。目前四十七頁\總數一百頁\編于十八點（二）動物細胞固定化動物細胞比菌體細胞、植物細胞更嬌嫩，需要最溫和的固定化方法。目前,動物細胞固定的方法有吸附法和包埋法兩種，其中吸附法用的最多。1.吸附法：由于大多數動物細胞屬于附著細胞，它們在培養過程中趨向于附著固體表面。因此，吸附法特別適合于制備固定化動物細胞。主要載體及固定方法有：（1）轉瓶法：轉瓶是由玻璃或塑料制成。（2）微載體法：微載體是指直徑為100～200um，相對密度接近于1.0的顆粒固定化載體。它是由表面帶有電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。（3）中空纖維法：中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。目前四十八頁\總數一百頁\編于十八點（二）動物細胞固定化2.包埋法：包埋法根據載體與方法不同，亦有凝膠包埋法和半透膜包埋法兩種。（1）凝膠包埋法：用于動物細胞固定化的凝膠主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖蛋白等。（2）半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊形固定化動物細胞。目前四十九頁\總數一百頁\編于十八點三、輔酶的固定化

由于輔酶與酶的結合不牢固，必須考慮將輔酶固定化。

1.原因：

（1）有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應；（2）有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生；（3）有機輔因子價格昂貴——工業上應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生。

2.固定化方法與酶相似，一般采用載體結合法和包埋法。如利用溴化氰法、碳二亞胺法以及重氮偶聯法等共價偶聯，或將其進行適當的化學修飾后固定在超濾器中。3.輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。目前五十頁\總數一百頁\編于十八點輔酶NAD+在瓊脂糖凝膠上的固定化目前五十一頁\總數一百頁\編于十八點目前五十二頁\總數一百頁\編于十八點第二節化學酶工程一、酶分子的化學修飾二、模擬酶三、抗體酶四、印跡酶目前五十三頁\總數一百頁\編于十八點生物酶工程與化學酶工程1.生物酶工程

(1)采用基因重組技術，利用微生物、動植物細胞作為生物反應器大量生產酶。(2)通過基因工程技術，使酶基因發生定位突變，產生遺傳性修飾酶(突變酶)。(3)設計新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。2.化學酶工程(1)自然酶：是指由生物材料中分離出來的酶。

(2)化學修飾酶又稱“生物分子工程”：是通過對酶分子實行“手術”以達到改構和改性的目的。(3)固定化酶：是將酶分子通過吸附、交聯、包埋及共價鍵結合束縛于某種特定支持物上而發揮酶的作用。具有能反復使用、產物易純化、可用微電腦控制，實行自動化連續化生產等優點。(4)人工合成酶：模擬酶的催化功能，用化學方法合成具有專一性的催化劑。目前五十四頁\總數一百頁\編于十八點一、酶分子的化學修飾

通過各種方法可使酶分子結構發生某些變化，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子的修飾。

通常把把改變酶蛋白一級結構的過程稱為改造，把側鏈基團的共價變化稱為修飾。（一）酶分子化學修飾的定義：通過對主鏈的“切割”、“剪切”和側鏈基團的“化學修飾”對酶蛋白進行分子改造，以改變酶分子的結構、理化性質及生物活性，這種應用化學方法對酶分子進行種種“手術”的技術，稱為酶分子的化學修飾。目前五十五頁\總數一百頁\編于十八點酶分子的化學修飾（二）酶分子修飾的意義1.改變活性部位的構象；2.提高酶的生物活力（activity）；3.增強酶的穩定性（stability）；4.降低或消除酶類藥物的抗原性（immunologicalproperty）；5.改變酶學性質：研究和了解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響（structure）。目前五十六頁\總數一百頁\編于十八點（三）酶化學修飾的原理、方法及修飾劑1.酶化學修飾的原理對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩定性：熱穩定性、酸堿穩定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）被修飾的酶：活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數等。（3）修飾條件的選擇：修飾反應盡可能在酶穩定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。①pH與離子強度：pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態。由于它們的解離狀態不同，反應性能也不同。②修飾反應的溫度與時間：嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。③反應體系中酶與修飾劑的比例：目前五十七頁\總數一百頁\編于十八點酶化學修飾的原理、方法及修飾劑（4）修飾劑的選擇：選擇修飾劑時要求具有較大的相對分子量，對蛋白質的吸附具有良好的生物相容性和水溶性，修飾劑表面有較多的活性基團，還要考慮修飾劑上的反應基團的活化方式和活化條件，以及修飾后酶活性的半衰期。修飾劑的選擇在很大程度上使依據修飾目的而定。修飾劑的大小也是選擇時要考慮的。目前五十八頁\總數一百頁\編于十八點酶化學修飾的原理、方法及修飾劑2.酶化學修飾的方法：（1）酶分子側鏈基團的化學修飾：①氨基的化學修飾：

來源：Lys,Arg,His,Gln。修飾反應：酰基化與烷基化。酰基化修飾劑:

三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）。烷基化修飾劑：2,4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等。②羧基的化學修飾：

修飾羧基的反應專一性較差。常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測定酶分子中羧基的數目。目前五十九頁\總數一百頁\編于十八點酶化學修飾的原理、方法及修飾劑③巰基的化學修飾

來源：Cys修飾反應:烷基化修飾劑：碘乙酸(IAA)、碘乙酰胺(IAM)、N-乙基馬來酰亞胺(NEM)(常用的專一修飾巰基試劑)。④咪唑基的化學修飾來源：His

修飾反應:酰基化與烷基化酰基化修飾劑:常用焦碳酸二乙酯（diethylparacarbonate）；

烷基化修飾劑：碘乙酸。目前六十頁\總數一百頁\編于十八點酶化學修飾的原理、方法及修飾劑⑤胍基的化學修飾來源：Arg修飾反應：本質上是羰基對氨基酰基化。修飾劑：二羰基化合物丁二酮、1,2－環己二酮、苯乙二醛。⑥吲哚基的化學修飾來源：Trp

修飾反應：氧化反應修飾劑：

N-溴代琥珀酰亞胺⑦酚羥基的化學修飾來源：Tyr修飾反應：芳香環取代反應

修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷）⑧甲硫氨酸殘基的化學修飾：目前六十一頁\總數一百頁\編于十八點酶化學修飾的原理、方法及修飾劑（2）酶分子表面的化學修飾①聚乙二醇對酶的修飾：聚乙二醇(PEG)用得最多的是分子量在5000～20,000范圍內的修飾劑，因為該類分子既能溶于水，又可以溶于大多數有機溶劑，是兩親分子，無免疫原和毒性，體內不殘留。

實際使用過程中多采用單甲基聚乙二醇(MPEG)的衍生物。如MPEG均三嗪類、MPEG的琥珀酰亞胺類、MPEG氨基類衍生物。②右旋糖酐及右旋糖苷硫酸酯對酶的修飾：是由葡萄糖通過α-1,6-糖苷鍵形成的多糖，具有較好的水溶性和生物相容性，可作代血漿用。目前六十二頁\總數一百頁\編于十八點酶化學修飾的原理、方法及修飾劑③糖肽對酶的修飾：是纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解纖維蛋白或球蛋白獲得。④具有生物活性的大分子對酶的修飾：常用的是肝素。是一種含硫酸酯的黏多糖。

⑤蛋白質或其它大分子對酶的修飾：主要是血清蛋白質。目前六十三頁\總數一百頁\編于十八點（四）修飾酶的化學性質1.修飾酶的穩定性得到提高；2.修飾酶的抗原性得到降低；3.修飾酶的最適pH值變化得更有應用價值；4.修飾酶的動力學性質：通常Km值改變。目前六十四頁\總數一百頁\編于十八點二、模擬酶第一節模擬酶概論第二節模擬酶的理論基礎和策略第三節模擬酶的分類和制備目前六十五頁\總數一百頁\編于十八點第一節模擬酶概論

模擬酶：根據酶的作用原理，用人工的方法合成的具有活性中心和催化作用的非蛋白質結構的化合物。1.模擬酶的金屬輔基：模擬酶研究的重要內容之一就是模擬酶分子中的金屬輔基的作用。2.模擬酶的活性功能基：模擬活性中心的幾個活性功能基團。3.模擬酶的高分子作用方式：利用高分子化合物作為模型化合物的骨架，引入活性功能基來模擬酶的高分子作用方式。4.模擬酶與底物的作用：利用合成的化合物來模擬酶的空間結構。如冠醚化合物空穴。5.模擬酶的形狀：目前六十六頁\總數一百頁\編于十八點第二節模擬酶的理論基礎和策略1.模擬酶的酶學基礎酶的作用機制：過渡態理論模擬酶的設計：一方面基于酶的作用機制；另一方面要基于對簡化的人工體系中識別、結合和催化的研究。目前六十七頁\總數一百頁\編于十八點第二節模擬酶的理論基礎和策略2.超分子化學基礎

主-客體化學：主體和客體在結合部位的空間及電子排列的互補。

超分子：該分子形成源于底物和受體的結合，這種結合基于非共價鍵相互作用，當接受體與絡合離子或分子結合形成具有穩定結構和性質的實體，形成超分子。功能：分子識別、催化、選擇性輸出。目前六十八頁\總數一百頁\編于十八點第二節模擬酶的理論基礎和策略3.設計要點（1）設計前：

※

酶活性中心-底物復合物的結構；

※

酶的專一性及其同底物結合方式的能力；

※

反應的動力學及各中間物的知識。（2）設計中：

※

為底物提供良好的微環境；

※

催化基團必須相對于結合點盡可能同底物的功能團相接近；

※

應具有足夠的水溶性，并在接近生理條件下保持其催化活性。目前六十九頁\總數一百頁\編于十八點第三節模擬酶的分類和制備一.根據Kirby分類法1.單純酶模型：化學方法通過天然酶活性的模擬來重建和改造酶活性。2.機理酶模型：通過對酶作用機制諸如識別、結合和過渡態穩定化的認識，來指導酶模型的設計和合成。3.單純合成的酶樣化合物：化學合成的具有酶樣催化活性的簡單分子。二.按照模擬酶的屬性①主-客體酶模型；②膠束酶模型；③肽酶；④抗體酶；⑤分子印跡酶模型；⑥半合成酶。目前七十頁\總數一百頁\編于十八點膠束酶模型目前七十一頁\總數一百頁\編于十八點水解酶模型模擬唯鐵氫化酶模型目前七十二頁\總數一百頁\編于十八點三、抗體酶（一）抗體酶的概念：

抗體酶（abzyme）又稱催化抗體（catalyticantibody），是指通過一系列化學與生物技術方法制備出的具有催化活性的抗體，它除了具有相應免疫學性質，還類似于酶，能催化某種活化反應。將這類具催化能力的免疫球蛋白稱為催化抗體，即抗體酶。它是利用現代生物學、化學的理論與技術交叉研究的成果，是一種對其可變區賦予了酶的屬性的具有催化功能的抗體分子，是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產物。目前七十三頁\總數一百頁\編于十八點抗體與酶的異同※相同點：都是蛋白質，都有特異性。※不同點：（1）抗體無催化活力，酶有催化活力。（2）本質差別：酶是能與反應過渡態選擇結合的催化物質，抗體是和基態緊密結合的物質。（3）酶的活性和合成受到代謝調節，種類有限。抗體只有在抗原存在時才產生，種類無限。目前七十四頁\總數一百頁\編于十八點（二）抗體酶的催化特性

1.抗體酶的理論基礎

過渡態理論認為，酶與底物的結合經歷了一個易于形成產物的過渡態，實際上是降低了反應所需的活化能。目前七十五頁\總數一百頁\編于十八點（二）抗體酶的催化特性利用抗體能與抗原特異結合的原理，以過渡態類似物作為半抗原來誘導與其互補構象的抗體，使其具有催化活性;這樣產生的抗體能特異地識別反應過程中真正的過渡分子，可觀察到抗體催化相應底物發生化學反應，降低反應的活化能達到催化反應的目的。目前七十六頁\總數一百頁\編于十八點2.抗體酶的特點（1）與天然酶相比抗體酶的特點

①能催化一些天然酶不能催化的反應：②有更強的專一性和穩定性：催化抗體作為一種具有酶和抗體雙重功能的新型生物大分子，用作分子識別元件，具有優于酶和抗體的突出特點。③催化作用機制不同：目前不太清楚。目前七十七頁\總數一百頁\編于十八點（2）抗體酶和非催化性抗體作用的比較①更高的反應特異性：②反應的可逆性：③反應的量效關系：抗原與抗體結合需要比例合適，任何一種過多都不利于反應；抗體酶與底物結合，在其它條件均合適的情況下，增加抗體濃度顯著加速酶反應。④反應過程：均可分為結合階段和反應階段。第一階段無差別，第二階段抗體酶催化底物分解，底物分子有變化。目前七十八頁\總數一百頁\編于十八點（三）抗體酶的催化機理（1）過渡態理論與抗體酶：（2）抗體酶催化的三種重要反應機制

①水解作用機制：②基團轉移：③連續反應機制：（3）抗體酶催化反應的介質效應①酯解反應中介質效應：抗體酶在有機溶劑中具穩定性。②脫羧反應中介質效應：有機溶劑引起脫羧反應速率增加。③酰基轉移反應中介質效應：在疏水溶劑中，活性較高。目前七十九頁\總數一百頁\編于十八點（四）抗體酶催化反應的類型1.轉酰基反應:2.水解反應:3.Claisen重排反應:烯丙基醚在高溫下重排成鄰烯丙基酚的反應。4.酰胺合成反應:5.Diels-Alder反應:又名雙烯加成，由共軛雙烯與烯烴或炔烴反應生成六元環的反應，是有機化學合成反應中非常重要的碳碳鍵形成的手段之一，也是現代有機合成里常用的反應之一。6.轉酯反應:7.光誘導反應:8.氧化還原反應:9.脫羧反應:10.順反異構化反應:目前八十頁\總數一百頁\編于十八點（五）抗體酶的制備方法

將抗體轉變為酶可通過誘導法、拷貝法、引入法、化學修飾法等途徑。

1.誘導法是利用反應過渡態類似物為半抗原制作單克隆抗體，篩選出具高催化活性的單抗即抗體酶。2.拷貝法主要根據抗體生成過程中抗原-抗體互補性來設計的。

3.引入法則借助基因工程和蛋白質工程將催化基因引入到特異抗體的抗原結合位點上，使其獲得催化功能。

4.化學修飾法對抗體進行化學修飾，使抗體與催化基團相連。目前八十一頁\總數一百頁\編于十八點（六）抗體酶的應用前景1.將不可能發生的反應變為可能；2.使苛刻條件下的反應變為溫和條件下的反應；3.可選擇性的催化平行反應中的某一反應，大大增加產品的產率；4.用于快速分析氨基酸序列；5.用病毒蛋白水解過程中的過渡肽類似物誘導抗體酶，可作為藥學上的接種疫苗；6.指導未知酶的尋找；7.抗體酶在幫助戒毒方面的應用：用人工抗體酶的被動免疫也許能阻斷可卡因上癮，達到戒毒目的；8.抗體酶用于腫瘤治療：目前正在發展一種稱為抗體介導前藥治療（ADEPT）技術，即將能水解前藥【前藥(prodrug)是指由具有生物活性的藥物經化學修飾后轉變為體外無活性的化合物。】釋放出腫瘤細胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯，這樣酶就會通過和腫瘤結合的抗體而存在于細胞的表面。抗體酶就會將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物，從而提高腫瘤細胞局部藥物濃度，增強對腫瘤的殺傷力，達到提高腫瘤化療效果的目的。目前八十二頁\總數一百頁\編于十八點印跡酶1．分子印跡概念：

制備對某一化合物具有選擇性的聚合物的過程。目前八十三頁\總數一百頁\編于十八點印跡酶2．分子印跡技術過程：（1）選定印跡分子和功能單體，使二者發生互補反應；（2）在印跡分子-單體復合物周圍發生聚合反應；（3）用抽提法從聚合物中除掉印跡分子。3．分子印跡酶：（1）通過分子印跡技術可以產生類似于酶的活性中心的空腔，對底物產生有效的結合作用，并可以在結合部位的空腔內誘導產生催化基團，并與底物定向排列。（2）性質：遵循米氏方程，催化活力依賴反應速度常數。目前八十四頁\總數一百頁\編于十八點印跡酶4.表面分子印跡：（1）無機物為載體的表面印跡：（2）固體材料的表面修飾：（3）蛋白質的表面印跡：目前八十五頁\總數一百頁\編于十八點第三節生物酶工程一、酶基因的克隆和表達二、酶分子的改造三、融合酶目前八十六頁\總數一百頁\編于十八點一、酶基因的克隆和表達目前八十七頁\總數一百