舉例說明黃酮的提取分離方法舉例說明黃酮的提取分離方法組長：崔寧組員：翟雪王璐璐馮子涵趙子惠羅春雨劉紅成提取方法1.1熱水提取法熱水提取法一般僅限于提取苷類.在提取過程中要考慮加水量、浸泡時間、煎煮時間及煎煮次數等因素.此工藝成本低、安全,適合于工業化大生產。以水做溶劑,同時提高浸提溫度、延長浸提時間和增加液料比(60倍),可以明顯提高蘆丁的產率。實例桑葉：采用熱水提取法測定桑葉中各有效成分含量，發現黃酮類化合物含量為1%以上,其中霜后桑葉黃酮類化合物含量最高為1.54%,其次是晚秋桑葉,春季桑芽和后期桑葉含量最低。甘草：過去甘草黃酮的提取主要為水提法,其主要原理通過甘草粉與水按一定配比,加熱混合至80～95℃浸提甘草粉,利用甘草黃酮的水溶性進而提取甘草黃酮。此法雖然要求設備簡單,但因提取雜質多、提取時間長、提取液存放易腐敗變質、后續過濾操作困難、收率較低等缺點,1.2有機溶劑萃取法其原理是利用黃酮類化合物與混入的雜質極性不同,選用不同的溶劑萃取。常用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等,一般采取乙醇為提取溶劑。高濃度的乙醇(如90%～95%)適于提取苷元,濃度60%左右的乙醇適于提取苷類。提取次數一般為2～4次,提取方法有熱回流提取和冷浸提取兩種方式。實例桑葉：使用乙醇提取桑葉中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇的濃度為70%，料液比為1:15，在80℃的條件下浸泡3h。使用多種有機溶劑提取發現桑葉中黃酮類化合物的最佳提取溶劑是60%丙酮西芹：使用無水乙醇為提取劑，按西芹鮮重與提取劑的比例(W/V)1∶2,在80℃下回流提取2～4h,制備西芹總黃酮銀杏葉：從銀杏葉中提取總黃酮時,隨乙醇濃度的增加總黃酮提取率逐漸上升,當乙醇濃度增至70%時提取率最高,之后反而下降,故選用70%的乙醇作浸提劑最佳。生姜：生姜黃酮提取用40倍原料的90%甲醇溶液,在60~65℃條件下提取4h為其優化組合,而其試驗組合中以用40倍原料的75%甲醇溶液,在60~65℃條件下提取1.3堿性水或堿性稀醇提取法黃酮類化合物大多具有酚羥基,易溶于堿水,酸化后又可沉淀析出。其原因一是由于黃酮酚羥基的酸性,二是由于黃酮母核在堿性條件下開環,形成2′-羥基查耳酮,極性增大而溶解。因此可用堿性水(碳酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鈣水溶液)或堿性稀醇(50%乙醇)浸出,浸出液經酸化后析出黃酮類化合物。實例菊花：各取5g干菊花4份,，在80℃恒溫水浴分別以pH為8,9,10,11的NaOH溶液分兩次溫浸1h和0.5h。pH降低時.由于提取不完全.含量較低；pH為11時,612%。1.6超臨界流體提取法超臨界流體提取技術系指以超臨界流體為萃取劑,從液體或固體中萃取有效成分并進行分離的方法。可作為SF的物質很多,其中,二氧化碳是首選的超臨界流體。隨著國際上超臨界流體提取技術迅速發展,用該技術提取植物中的活性成分愈加廣泛。實例金銀花：采用超臨界CO2萃取技術萃取金銀花中總黃酮，考察壓力、溫度、時間和夾帶劑對總黃酮提取率的影響,并同熱醇浸泡提取法、微波提取法和超聲提取法的得率進行比較;得到超臨界CO2萃取最佳條件為:壓力30Mpa、溫度40℃、時間120min和夾帶劑用量4.5ml/g時,提取得率最高。同熱醇浸泡提取法、微波提取法和超聲提取法相比,其總黃酮得率分別為8.92%、9.56%、9.32%、和10.24%;超臨界CO2提取方法同其他方法相比,得率高、時間短,是一種合適的提取金銀花中總黃酮的方法甘草：超臨界CO2萃取法對甘草粗黃酮提取率比常規溶制法高2.2倍。采用超臨界萃取法從銀杏葉中提取黃酮類化合物,實驗表明,超臨界CO2法可有效提取銀杏葉中的黃酮類化合物,其中黃酮含量達28%以上,高于歐洲EGb761質量標準(24%);且黃酮得率、回收率都較高(分別>4%和>64%),產品中無有害物質殘留,銀杏葉中的有毒物質銀杏酚酸的含量得到較好控制(<35x10^-6).茵陳蒿:與溶劑提取法相比超臨界二氧化碳萃取法具有操作簡單、提取率高、后續分離易于進行、品質較高等特點。100g原料,當pH值為9~10的70%乙醇做夾帶劑,用量600ml、萃取壓力30MPa、萃取溫度55℃,CO2流量20L/h、萃取時間150min時,茵陳蒿總黃酮的提取率最高,為3.875%1.7雙水相萃取分離法雙水相萃取技術(ATPE)分離原理是物質在雙水相體系中的選擇性分配，它是利用待分離物質在兩相間具有分配系數，通過溫度誘導相分離實現分離目的。由于天然植物中所含的化合物眾多,而雙水相萃取技術具有較高的選擇性和專一性,因此利用這些技術有希望為從天然植物中提取有效藥用成分開辟一條新的思路.實例黃芩（qin）:利用雙水相體系分離純化黃芩苷，通過實驗選擇非離子表面活性劑聚乙二醇(PEG)-K2HPO3-H2O雙水相體系的成相條件及溫度，pH值，聚合物的分子量等因素對黃芩苷得率的影響。結果發現黃芩苷在最佳分離條件下的萃取率為98.6％。證明按本文方法所形成雙水相體系，操作簡便，萃取率高，方法重現性好，可適用工業化生產。葛根素:采用聚乙二醇(PEG)/(NH4)2SO4雙水相體系時,最大的分配系數可達148.2,最大收率99.09%。采用丙酮/K2HPO4雙水相體系時,最大的分配系數可達36.7143,最大收率99.55%,葛根素大部分被分配在丙酮相(上相)中。研究葛根素在乙醇/硫酸銨兩水相體系中的分配特性及其影響因素,在其最佳萃取條件時,最大的分配系數可達16.30,回收率94.33%,葛根素分配在上相。1.8大孔吸附樹脂提取法吸附樹脂是近10年來發展起來的一類有機分子聚合物吸附劑,其具有物理化學穩定性高、吸附選擇性獨特、不受無機物存在的影響、再生簡便、解吸條件溫和,使用周期長、宜于構成閉路循環,節省費用等優點,現已廣泛用于黃酮類物質的提取。實例銀杏葉：應用D101吸附樹脂精制制得含黃酮約38%的GBE產品。也有用ZTC澄清劑沉降,在酸性條件下吸附,制得GBE成品的黃酮含量穩定在26%以上,內酯穩定在6%以上。比較研究表明,AB-8樹脂對銀杏葉黃酮是一種優良的吸附劑,國內首次報道了D101和聚酰胺樹脂(1B1)混合使用純化銀杏葉黃酮醇苷,制得黃酮醇苷純度大于24%的銀杏葉提取物。金菊雙花：篩選金菊雙花總黃酮的最佳提取與純化工藝。結果最佳提取工藝為8倍量55%乙醇、100%水浴、每次1h回流提取2次,再結合D101大孔吸附樹脂純化,水、30%乙醇、70%乙醇梯度洗脫,收集70%乙醇洗脫部分濃縮干燥,測定黃酮含量為62.7%。枇杷葉：枇杷葉煎煮液經大孔樹脂吸附,用70%乙醇洗脫,洗脫液濃縮后用乙醇溶解,沉淀去雜后減壓濃縮,經真空干燥,得到黃色粉末,其黃酮含量43%以上。1.9超濾法提取本法是以超濾膜兩側的壓力差為驅動力,凡含有兩種或兩種以上溶質的溶液,通過濾膜分離流動時,其中分子體積小的溶質,經濾膜流出,而分子體積較大的溶質,不能通過濾膜而被截留.它可以有效的阤去提取液中蛋白質、多糖、高分子單寧以及部分原花色素等雜質。它的特點是在嘸溫下進行、除雜效率高、分析過程中無相變、有效成分理化性能穩定,結果重復性好,準確性高,超濾裝置可反復使用，但同時對超膜的要求也相當高。實例洋蔥皮：取洋蔥皮粉末1g，按料液比l∶40加入體積分數為60%的乙醇溶液，在超聲功率180W、提取溫度50℃的提取條件下超聲10min，抽濾，濾渣在相同條件下再次提取，合并濾液并過雙層濾紙后工藝流程：黃酮提取液→離心→抽濾→超濾→真空冷凍干燥→洋蔥皮黃酮產品。得出結論：采用截留分子質量30000的超濾膜對黃酮提取液進行純化，產品黃酮質量分數達到32.78%，黃酮遷移率達到91.73%。確定了截留分子質量30000膜的最佳超濾工藝：操作壓力為0.2MPa，料液濃度為0.50mg/mL，超濾溫度為30℃1.10酶解法酶解法對于一些黃酮類物質被細胞壁包圍不易提取的原料比較實用。其原理是用相應的酶充分破壞以纖維素為主的細胞壁結構及其細胞間相連的果膠,使植物中的果膠完全分解成小分子物質,減少提取的傳質阻力,使植物中的黃酮類物質能充分釋放出來。實例甘草：利用纖維素酶、果膠酶處理甘草提取甘草黃酮,研究發現復合酶法提取的最佳條件:以纖維素酶、果膠酶組成的復合酶,在40℃,pH5.0的條件下酶解3h,提取率可達1.66%,與微波法提取率相當。酶法提取與微波法提取相比,提取成本低,耗能低,芹菜：準確稱取一定量芹菜干粉，放入三角瓶中，加蒸餾水混勻，設定酶解條件（不同酶類、加酶量、ｐＨ值、溫度、時間、固液比），進行酶解提取，抽濾，得提取液，通過觀察不同的酶對芹菜黃酮得率的影響，采用果膠酶、果膠酶與纖維素酶復合酶進行酶法浸提，芹菜黃酮的得率沒有明顯的提高；而采用單一的纖維素酶，芹菜總黃酮得率大大提高。正交試驗結果得出，酶法提取芹菜黃酮的最佳工藝條件為：采用纖維素酶，酶濃度為２Ｕ／ｍＬ，溫度為55℃，ｐＨ為4.5，酶解時間為2.分離方法2.1聚酰胺柱層析法聚酰胺柱層析法分離效果好,樣品容量大,適于在制備分離工藝中應用。但洗脫速度慢,死吸附較大(損失有時高達30%),常有低分子量酰胺的低聚物雜質混入,裝柱時用5%甲醇或10%鹽酸預洗除去低聚物。實例以甲醇-氯仿為洗脫劑,用聚酰胺層析柱對各種黃酮甙類進行分離,效果好。2.利用硅膠層析柱(氯仿-甲醇作洗脫劑)和聚酰胺層析柱(水-甲醇作洗脫劑)配合分離,從黃芩中分離出11種黃酮類化合物。3.利用聚酰胺層析柱,水和乙醇梯度洗脫,從金錢草中分離到5種黃酮類化合物。2.2硅膠柱層析法此法應用范圍最廣,非極性與極性化合物都能用,適用于分離黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類、黃酮苷元類.少數情況下,在加水活化后也可以用于分離極性較大的化合物,如羥基黃酮醇類及其苷類等.與硅膠混存的微量金屬離子,應預先用濃鹽酸處理,以免干擾分離效果。實例1．硅膠主要用于分離極性較低的黃酮類化合物如異黃酮、黃烷類、二氫黃酮(醇)和高度甲基化或乙酰化的黃酮和黃酮醇。如用乙醚-氯仿溶劑系統從野靛（dian）中分離異黃酮類。2.硅膠柱層析法分離大豆異黃酮苷元經丙酮萃取后，大豆異黃酮苷及其苷元約占總量的20%左右，染料木素約占其中的14.71%、黃豆黃素3.73%、大豆素為11.58%；經硅膠柱二氯甲烷和乙酸乙酯的梯度洗脫，可以分離得到3種大豆異黃酮苷元異構體；經HPLC檢測，3者的純度均超過90%故用硅膠柱層析法可以成功地分離出染料木素黃豆黃素和大豆素3個大豆異黃酮苷元單體。2.3葡聚糖凝膠柱層析法葡聚糖凝膠(主要有SephadexLH-20型和Sephadex-G型)是一種淋洗速度快、可以反復使用、沒有損失的非常好的分離和純化黃酮類化合物的填充材料。其中SephadexLH-20的洗出液中不含雜質,適用于從紙色譜分析、硅膠及聚酰胺柱色譜中分離出來的黃酮類化合物糖甙配基及糖甙的最終純化。葡聚糖凝膠在分離游離黃酮時,主要靠吸附作用,吸附程度取決于游離酚羥基的數目,游離酚羥基的數目越多越難以洗脫;在分離黃酮甙時,則分子篩的屬性起主導作用,相對分子質量的大小或含糖的多少決定化合物被洗脫。實例如用甲醇作洗脫劑,從SephadexLH-20柱洗出下列物質先后順序為:刺槐甙(山萘酚-3-半鼠李糖-7-鼠李糖甙)、蘆丁(雙糖)、槲（hu）皮甙(單糖)、芹菜素(5,7,4′-三羥基黃酮)、山萘酚(3,5,7,4′-四羥基黃酮)、槲皮素(3,5,7,3′,4′-五羥基黃酮).2.對大豆異黃酮主要單體進行分離采用LH220葡聚糖凝膠柱,用90%甲醇作洗脫劑,可得到含量高達95%以上的大豆苷和染料木甘。2.4吸附樹脂分離法大孔吸附樹脂具有吸附快、吸附容量大、吸附選擇性好、解吸條件溫和、洗脫率高、物化穩定性高、不受無機物存在的影響、再生簡單、使用周期長、易于構成閉路循環、節省費用等優點,適宜工業化生產。實例1.弱極性AB-8大孔樹脂對葛根黃酮、銀杏葉黃酮進行吸附分離,提取物中黃酮含量提高近1倍。用D101型樹脂成功地純化了銀杏葉中的黃酮類化合物,效果良好。膜分離純化法膜是具有選擇性分離功能的材料,利用膜的選擇性分離實現料液的不同組分的分離、純化、濃縮的過程稱作膜分離。它與傳統過濾的不同在于,膜可以在分子范圍內進行分離,并且這過程是一種物理過程,不需發生相的變化和添加輔助劑。膜的孔徑一般為微米級,依據其孔徑的不同(或稱為截留分子量),可將膜分為微濾膜、超濾膜、納濾膜和反滲透膜等。實例膜分離技術在葛根黃酮上的應用采用陶瓷膜超濾系統，通過超濾過濾，在水提浸提液條件下，所得濾液質量相對較低，但加水量大幅減少，葛根黃酮收率可保持在98%以上。2.6高速逆流色譜分離純化技術高速逆流色譜分離純化技術的原理是利用兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡,當其中一相作為固定相,另一相作為流動相,在連續洗脫的過程中能保留大量的固定相,物質的分離依據其在兩相中分配系數的不同而實現。與其他各種色譜分離技術的根本差別在于,高速逆流色譜分離純化技術不采用任何固態的支撐體(如柱填料、吸附劑、親和劑、板床、篩膜等),因此完全排除了因不可逆吸附而引起的樣品污染、變性、失活等,不僅使樣品能夠全部回收,回收的樣品也能反映其本來的特性,特別適合于天然產物活性成分的分離、純化。實例黃芩中總黃酮的提取及高速逆流色譜分離純化實驗得出提取黃酮乙醇濃度（60%）、溶劑用量（12倍，10倍），提取時間（2h，1h），提取二次為最佳提取工藝條件。用紫外分光光度法測定樣品在本溶劑體系不同比例中的分配系數。稱取適量（約2mg）總黃酮粗提物置于5mL試管中，分別加入已經達到平衡的上、下相溶劑各1mL，振蕩使樣品充分溶解，靜置平衡，分取上、下層溶液，用紫外分光光度法測定溶劑體系上、下層所含總黃酮的濃度，求得二者樣品在該溶劑系統中的分配系數（K）。根據試驗結果，選擇氯仿-甲醇-水-醋酸（4∶3∶3∶0.1，V/V）作為分離純化黃芩中總黃酮的高速逆流色譜分離純化技術兩相溶劑體系。2.7pH梯度萃取黃酮類化合物中有酚羥基的取代而顯酸性,并且由于羥基的數目和位置不同,酸性強弱也不同,利用這一特性,將植物提取的總黃酮溶于有機溶劑中,依次按弱堿至強堿,從稀堿至濃堿的水溶液的順序進行萃取,就可以將黃酮按較強酸性至較弱酸性的順序分別萃取出來.實例將混合物溶于有機溶劑乙醚后,依次用5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH、5%NaOH水溶液萃取,可依次萃取出7,4′-二羥基黃酮、7-羥基黃酮或4′-羥基黃酮、一般酚羥基黃酮、5-羥基黃酮。2.8高效液相色譜法自20世紀70年代以來,應用高效液相色譜法已成功地分離了大量的黃酮類化合物,在分析中,以C18柱與C8柱最為常用,柱內填充粒徑以10、5μm用的最多。由于黃酮類化合物常帶有酚羥基,在水中會部分解離,而未解離的羥基與固定相作